导图社区 细胞生物学研究方法与技术
下图梳理了细胞生物学研究方法与技术，包括细胞培养技术、分析细胞学技术、细胞工程技术、细胞化学技术、显微镜技术等。
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细胞生物学研究方法与技术
细胞培养技术
内容
在无菌、是当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行抚育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于观察研究
优点
获得大量细胞，便于研究细胞的结构、功能和各种生命活动规律细胞能在培养过程中进行分化，培养细胞能对药物、激素、生长因子等刺激产生应答
局限性
细胞离体后失去与体内环境的密切联系，失去了神经-体液的调节和不同细胞间的相互作用，使体内外细胞出现了差异
细胞培养的基础知识
培养细胞的类型认定
贴壁细胞
正常贴壁细胞具有接触抑制的特性，细胞不会相互重叠于其上生长，细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积
悬浮细胞
胞体为圆形，其优点是在培养液中生长，生存空间大，便于大量繁殖
培养细胞的条件和细胞的增殖过程
传代
当细胞达到一定密度后将增殖，则需分离出一部分细胞接种到其它容器并及时更新培养液
细胞系
人的细胞系一般来自人的肿瘤或经致癌病毒或化学试剂处理过的细胞
细胞培养的基本技术
细胞分离和原代培养
内含
原代培养指直接从生物体获取、分离细胞后进行首次培养
培养细胞的传代
方法
贴壁细胞的消化传代多用混合了胰蛋白酶和EDTA的消化液消化，形成细胞悬液后再加入新鲜培养基
悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液或离心收集后换新鲜培养液
细胞的冷冻保存和复苏
冻存前需向培养基中加入甘油或二甲基亚砜等保护剂，以减少冰晶对细胞的损伤
原则
慢冻快融，细胞冻存时要逐步降低冷冻温度，复苏时即刻放入37摄氏度水浴中
分析细胞学技术
从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成和含量以及细胞的各种功能等进行研究的科学
领域
流式细胞分析技术
将流体喷射技术、激光技术、空气技术、r射线能谱术及计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器
特点
速度快、精度高、准确性好
目的
细胞分选
显微分光光度术
由主控计算机、多功能显微镜、透射和入射光源、单色仪、高精度扫描台和光电倍增管等构成
快捷简便、所用材料少、可定位测定单个细胞或细胞器内的多种物质及细胞的代谢产物
显微吸收高度测量
使用不同的荧光染料可以与某些基团特异性地结合，从而使不同的细胞分组分染上不同的颜色，在显微镜下成为可见结构
公式
A【吸光度】=-lgT=lgI/I=K.C.L[T溶液透光率，I和I入射光强和透射光强，K吸收常数，C吸光溶质浓度L，光程】
条件
待测物质为均质
校测均质方法
双波长法、一波二区法和扫描法
显微荧光光度测量
敏感度高、可避免分布误差、可由计算机定位，可快速测量，适于大样本分析
缺点
荧光易衰减，有漂白作用，有时会淬灭，还必须减去本底荧光值
细胞工程技术
对细胞在整体、细胞器、等不同结构层次进行改造
细胞融合
概念
在细胞自然生长的条件下，或其它人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程
单克隆抗体技术
细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆技术抗体技术的成功
融合产生的杂交瘤细胞经过进一步筛选和克隆化，获得具有稳定生长和抗体分泌功能的单克隆杂交瘤细胞，是高度特异性的针对单一抗原决定簇的均质抗体
细胞核移植
将来自胚胎细胞或体细胞一个双倍体的细胞核移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中
克隆动物的产生
高等动物高度分化的成体动物细胞核仍具有发育全能性
基因转移
将外源目的基因或DNA片段引入受体生物或细胞并使其表达的一种技术
物理方法
裸露DNA直接注射、电穿孔、基因枪和显微注射
化学方法
磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、脂质体法。适用方法是通过增加细胞膜的通透性、正加胞吞或胞饮、增加DNA与细胞的吸附等机制而实现转移的
生物学方法
主要指病毒介导的基因转移
目前常使用的病毒载体包括DNA病毒载体和RNA病毒载体等
用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒
病毒载体会诱导宿主体内产生一定的免疫反应；病毒载体存在一定的安全隐患；而且其转导能力有限。不适于大规模生产
转基因和基因敲除动物
转基因动物
将外源从组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体内表达外源基因的动物
显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、电脉冲法、精子载体导入法等
基因敲除动物
通过一定途径使机体持定的基因缺失或失活的技术
基础
建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术上
应用范围
广泛使用的基因敲除动物是小鼠，大鼠尚未普及
CRISPR
简便、高效、快速
细胞生物学研究法法和技术与医学关系
显微镜技术与临床病理诊断
光学显微镜
可以判断肿瘤细胞的最初来源，以便制定相应的有效治疗方法
电子显微镜
能够观察到更为细微的细胞结构、更好的起到良好的补充和修正作用
流式细胞技术与医学检验
病毒抗原的检测
用途
检测细胞内的病毒抗原，也可以检测受感染细胞表面的病毒抗原；可以同时在同一样品中检测多种病毒抗原
免疫相关检测
有助于研究各种与免疫有关疾病的发病机制
荧光原位杂交技术与染色体遗传病检测
荧光原位杂交技术原理
在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记技术取代传统的放射核素标记的一种新的原位杂交技术
FISH的基本原理是将DNA或RNA探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA显微切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA显微切片上的定性、定位、相对定量。FISH具有安全快速灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点
荧光原位杂交技术在检验染色体遗传病中的应用
FISH在细胞遗传学中的应用是染色体涂染
提高了产前筛查染色体遗传病的准确率
基因治疗
将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗目的
采用病毒载体
携带外源基因片段大小受限、已引起机体免疫反应以及制备、储存、质量控制比较困难
细胞结构成分的离心分离技术
过程
首先需要破碎细胞并制成悬液之后根据他们各自特异的大小和密度，其中包含了细胞核、线粒体、高尔基复合体、溶酶体、过氧化物酶体等多种膜包围的囊泡，采用高速或超速离心的方法分离开来
原理
沉降系数
S＝2r²（p1－p2）╱9η
沉降速度
公式表示：V（颗粒沉降速度）＝2r²（颗粒直径)（p1〔颗粒密度〕－p2〔介质密度〕）╱9η〔介质粘度〕 ×g（作用于颗粒的离心力） 颗粒越重，其沉降的速度就越快
关系
沉降系数与颗粒直径、颗粒密度、介质密度和介质黏度有关。在介质密度和黏度密度恒定的条件下，S沉降系数主要与颗粒的大小和密度有关是表示颗粒大小和密度的参数。沉降系数的单位【1-20】·0。0000000000001秒
分类
差速离心法
用法
通过一系列递增束度的离心，将不同大小颗粒分离。
首先在低速离心条件下将大的颗粒沉降到管底，然后将上清液以较高的速度离心，使其中较大的颗粒沉淀于管底，这样依次把不同大小的颗粒逐级分离。被使用于初步离心分离
难以获得纯化的特定的细胞器，需要将粗制品进一步纯化处理
移动区带离心法
用于差别较小的颗粒
具体方法
分离的样品放在介质溶液表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度管底方向移动，形成一系列区带，在最大的颗粒尚未到达管底时停止离心，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分
局限
介质的密度必须小于颗粒的密度
等密度离心法
运行
当颗粒密度等于介质密度时，离心时颗粒悬浮于介质中不动
采用各种颗粒密度范围的梯度介质，将要分离的样品放在密度梯度液表面或混悬于梯度液中。通过离心，使不同密度的颗粒或上升或下沉，当到达与他们相同密度介质的介质区带时，颗粒不在移动，结果不同密度的颗粒位于各自的密度区带。停止离心后，可由管中不同位置的各密度区带收集不同密度的颗粒
实验方法
实验条件的选择
根据所研究颗粒的大小和密度选择离心方法
介质材料的选择
溶液密度范围大、粘度低，对细胞成分损伤小，离心分离后容易剔除，浓度容易测定
细胞器的分离
破碎细胞
在分离细胞器之前必须破碎细胞、释放细胞器。
低渗、超声、研磨、匀浆、冻融等，最常用的是细胞匀浆
细胞器的初步分离
先用500-1000g的低速离心，只有大的细胞器如细胞核和未破碎的细胞会沉降到管底；将第一次离心的上清液用10000-20000g离心，使中等大小的细胞器沉降下来；再将第二次离心的上清液用更高的速度离心，使小的细胞器沉淀，上清液中剩下的胞质溶胶的有关成分。
细胞器的纯化
利用电镜做形态鉴别
用生物化学的方法鉴定每种细胞器中的特殊标志性的分子
细胞化学技术
内涵
在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应研究细胞内各种成分的分布情况以及这些成分在细胞活动中的动态变化的技术
技术
光镜和电镜水平的酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术和原位杂交技术等
酶细胞化学技术
通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布以及酶活性强弱、用电镜观察酶的分布
在一定条件下，利用组织细胞内的酶与其底物相互作用形成初级反应产物，再用捕捉剂反应产物形成在显微镜下可见的最终反应产物，使其在显微镜下可见
表现
光镜
鲜明的颜色
电镜
高电子密度
免疫细胞化学技术
将免疫学原理和细胞化学相结合的技术，利用抗原抗体特异结合的特性，检测组织和细胞中特异大分子的存在和分布 包括电镜水平和光镜水平的免疫细胞化学技术
把组织中的特异分子作为抗原，利用标记物标记特异抗体或抗原抗体复合物，使特异的免疫化学反应具有可见性从而间接地显示该特异细胞在细胞或细胞器水平的定位
运用范围
将免疫学原理与化学细胞相结合的技术，利用抗原抗体特异结合的特性，在原位检测细胞内的蛋白质、多肽、核酸、多糖、磷脂等大分子物质
标记抗体与细胞内抗原结合的方式
直接法
用标记的特异抗体直接检测相应抗原
间接法
用未标记的特异抗体与组织中的抗原相结合，再用标记的第二抗体与第一抗体相结合，间接检测组织中的抗原。灵敏度更高
原位杂交技术
将分子杂交与细胞化学相结合的技术，是以标记的核酸分子做探针，检测特异核酸分子在细胞中的位置中心
使用特异序列的标记后的核酸单链即探针，在适宜的条件下与细胞中的互补核酸单链的靶序列发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子
标记物种类
放射性同位素
非放射性物质
探针包括
DNA/RNA以及寡核苷酸探针
显微镜技术
普通光学显微镜
相差显微镜
荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜
构造
电磁波透镜聚焦
镜筒中要求高真空
图像需要用荧光屏或感光胶片来记录
透射电子显微镜
原理与构造
发展最早 应用最广的电镜
主要用于观察组织 细胞内部的亚显微结构和蛋白质以及核酸等生物大分子和病毒的形态结构
组成
照明系统
电子枪，聚光镜
成像系统
样品室，物镜，中间镜和投影镜
观察记录系统
观察室和底片室
发展
冷冻电子显微镜
本质
利用电子散射机制
基本原理
把样品迅速冷冻，防止形成大块冰晶而破坏蛋白质结构
成就
解决了之前X线晶体衍射的传统方法研究结构生物学所面临的结晶困难问题
扫描电子显微镜
观察细胞表面结构，利用二次电子信号成像，观察样品表面形貌，其图像具有立体感
标本成像的过程
扫描电子显微镜的样品制备首先乙醇脱水，然后通过临界点干燥，保持标本性状和表面特性的前提下去除水分。标本干燥后在上覆盖一层重金属。电子被加速聚焦形成电子束，作为探针在标本表面扫描，被标本反馈后，检测器可通过检测阴极射线管中的反射电子束的强度并对其加以放大、转换、最终在屏幕上形成图像
优势
三维立体感，用于观察细胞表面结构和各种生物学过程，以及细胞外物质与坏境的相互作用
