2.7目的基因的克隆与基因文库的构建

这是一篇关于2.7目的基因的克隆与基因文库的构建的思维导图，基因文库:是指某一特定生物体全基因的克隆集合。

2.7目的基因的克隆与基因文库的构建

• 目的基因的克隆
  • 鸟枪法
    • 适用于原核细菌
      • 标准鸟枪法操作程序
        • 目的基因组DNA片段的制备
          • 机械切割：供体染色体DNA可用机械方法随机切割成平头片段
          • 限制性内切酶部分酶解：识别序列为四碱基对的限制性内切酶部分降解染色体DNA
          • 特点限制性内切酶全部酶解：切割已知目的基因两侧酶切位点
        • 外源DAN片段的全克隆
          • 一般选择质粒或λ-DAN作为克隆载体受体细胞一般选择大肠杆菌
        • 期望重组子的筛选
          • 菌落原位杂交法
            • 需要理想的探针
          • 外源基因产物功能检测法
            • 依赖于简便筛选模型的建立
        • 目的基因的定位
          • 通过亚克隆在已知克隆的DNA片段上准确定位目的基因
      • 从琼脂糖凝胶电泳上回收DAN
        • 冻融法
        • 滤纸法
        • 吸附法
        • 溶解法
        • 低熔点琼脂法
  • cDNA法
    • 适用于真核生物
      • mRNA的分离纯化
        • 进样-结合-层析-洗脱
      • 双链cDNA的体外合成
        • 自身合成法
          • cDNA与mRNA的杂交体通过煮沸或用NaOH溶液处理
        • 置换合成法
          • cDAN-mRNA与RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I混合获得残存mRNA，DAN聚合酶I以残存的mRNA作为引物合成cDNA
        • 引物合成法
          • 在第一链合成完毕后，变性残留的mRNA,用末端脱氧核苷酰转移酶在eDNA游离的3‘羟基上添加同聚物末端，然后将之与人工合成的oligo-dG退火，形成引物结构，在Klenow酶的作用下合成第二条cDNA链。
      • 双链cDNA的克隆
        • 步骤
          • 1：在人工合成oligo- -dT引物的同时，于其5'端接上含有Sal I识别序列的寡聚核苷酸片段，组成复合引物。
          • 2：它与mRNA退火后，在反转录酶作用下合成cDNA第一链， 然后用NaOH溶液水解杂合双链中的mRNA链，获得的单链cDNA用TdT添加dC同聚尾。
          • 3：cDNA 第二链采用引物合成法制备，所使用的引物是含有Sal I酶切位点和寡聚鸟嘌呤核苷酸的DNA单链片段，在Klenow酶的作用下，聚合反应分别在两条链上进行，最终形成两端各有一个Sal I酶切口的双链eDNA分子，它经Sal 1消化后，即可直接克隆在pBR322或pUC18的相应位点上。
      • cDNA重组克隆的筛选
        • 期望重组子筛选法
        • 探针原位杂交法
        • 差示杂交法
          • 一组中具备目的基因转录成相应的mRNA的条件，另一组中同样的目的基因并不表达至于这个目的基因的序列或功能无需知道。
  • PCR扩增法
    • PCR扩增DNA的基本原理
      • 本质是根据生物体DNA的复制原理在体外合成DNA,需要DNA单链模板,引物,DNA聚合酶以及缓冲系统
        • 变性
        • 退火
        • 延伸
    • PCR扩增产物的克隆
      • In-Fusion克隆程序
    • PCR扩增技术的应用
      • 扩增DNA靶序列并直接测序
      • DNA靶序列的突变分析
      • 痕量DNA样品的检测与分析
  • 化学合成法
    • ·应用条件：目的基因的全序列已知且长度不超过50个碱基
      • 寡聚核苷酸单链的化学合成
      • 目的基因的化学合成
        • 小片段黏接法
        • 补丁延长法
        • 大片段酶促法
      • 大片段酶促法
• 基因文库的构建
  • 基因文库的完备性
    • 定义：从基因文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率
  • 基因文库的构建战略·
    • 方法
      • 鸟枪法
        • 基因组文库
      • cDNA法
        • cDNA文库
  • 基因文库重组克隆的排序
    • 方法
      • 染色体走读法
        • 原理
          • 从某基因组文库中任取 重组克隆， 提取其重组DNA,并将插入片段两个末端的DNA区域(0.2~2kb)亚克隆在新的质粒DNA上进行扩增，然后以这两个末端DNA片段为探针，分别搜寻基因组文库。
      • 染色体跳跃法
        • 原理
          • 利用酵母人造染色体构建人基因组文库，其装载量可高达数百碱基对，同时构建非随机末端的DNA片段库，以此作为杂交探针，可以最大限度地减少两个克隆DNA片段之间的重叠程度
  • 基因文库的筛选
    • 目的基因背景知识
      • (1)目的基因的部分或全部碱基序列已知。
      • (2)目的基因编码产物的结构或功能已知。
      • (3)目的基因与某些生物表型(如疾病等)的相关性已知。
• 在真核生物尤其是高等哺乳动物基因组中，存在着大量的重复序列，它们短则数十碱基对，长则高达数百碱基对。如果所选用的探针片段含有这种重复序列，染色体走读法便不能有效进行下去
• 基因文库的构建就是将生物体的全基因分成若干DNA片段，分别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导人受体细胞中，形成一整套含 有该生物体全基因组DNA片段的克隆，并将各克隆中的DNA片段按照其在细胞内染色体上的天然序列进行排序和整理，因此某一生物体的基因文库实质上就是一个基因银行。人们既可以通过基因文库的构建储存和扩增特定生物
• 基因文库：是指某一特定生物体全基因的克隆集合
• 分离纯化寡聚核苷酸
• 从柱上释放寡聚核苷酸
• 氧化
• 加帽
• 清洗
• 活化与偶联
• 清洗
• 脱三笨甲基
• 清洗
• 将首位核苷酸接柱