导图社区 基因工程技术路线图
这是一个关于基因工程技术路线图的思维导图，包含目的基因的筛选与获取、 基因表达载体的构建、 将目的基因导入受体细胞等。
这是一个关于细胞工程的思维导图，细胞工程是一个综合性的生物技术领域，它涵盖了植物细胞工程、动物细胞工程和胚胎工程等多个方面。可以作为学习笔记和复习资料，帮助大家系统地回顾和巩固所学知识，学生更好地理解和记忆知识。
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基因工程技术路线图
1.目的基因的筛选与获取
目的基因：改变受体细胞形性状/获得预期表达产物等的基因---编码蛋白质的基因…
❶筛选+获取目的基因
目的基因未知
构建基因文库：cDNA文库…
测序技术/序列数据库、序列比对工具
目的基因已知 （从相关已知结构和功能清晰的基因中筛）
人工合成---转基因抗虫棉…
提取
❷利用PCR特异性扩增目的基因 （聚合酶链式反应）
原理：DNA半保留复制 （对目的基因的核苷酸序列大量复制）
体外提供条件：
体外用高温代替解旋酶
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制模板
4种脱氧核糖核苷酸/dNTPs
合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶
催化合成DNA子链
真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活
引物
DNA聚合酶从引物的3"端开始连接脱氧核苷酸
设计引物
要两种，分别与两条模板链互补结合
5”—3”延伸，相向而行
是特异性序列，20-30个碱基（碱基数量、温度上升提升特异性）
保守序列
①变性
90℃以上，双链DNA解聚为单链
②复性
下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，（形成双链）
③延伸
再上升到72℃左右，四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则在DNA聚合酶作用下形成新的DNA链 （氢键）
重复循环，每次延伸后的产物作为下一次的模板 目的基因=2的n次方=得到的DNA分子数 3轮后：得到2条链等长的，两种引物都消耗7个
应用
❸琼脂糖凝胶电泳
鉴定PCR产物 （除杂，分辨基因片段）
凝胶中DNA分子的迁移速率，和凝胶浓度 DNA分子的大小和构象有关
2.基因表达载体的构建
目的：让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代（使基因表达，发挥作用）
条件
目的基因
标记基因
用于重组DNA分子的筛选
四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因…
启动子
一段有特殊序列结构的DNA片段，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录出mRNA
人工构建诱导型启动子，激活/抑制目的基因表达
终止子
同上，使转录在需要的地方停下
载体
噬菌体，动植物病毒等
质粒
环状双链DNA分子
有一个至多个限制酶切割位点，可自我复制
如何构建
①限制酶切割载体：识别特定核苷酸序列（6..），使磷酸二酯键断开 从原核生物中分离纯化
黏性末端
EcoR 1
平末端
Sma1
②同种限制酶/产生相同末端的限制酶 切割含有目的基因的DNA片段
目的基因两端要有相应酶的识别序列；设计引物时，在5”端加入酶切位点的序列
③DNA连接酶 将目的基因片段拼接到载体切口 恢复磷酸二酯键，缝合双链DNA片段
防止
目的基因自身环化，反接
3.将目的基因导入受体细胞
植物
花粉管通道法
（基因表达载体通过一定方式进入受体细胞）
微量注射器将该DNA溶液注入子房
植物受粉后一定时间内减掉柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上
农杆菌转化法
将目的基因导入细胞
（自然侵染双子叶，裸子植物） 农杆菌细胞内含Ti质粒，上有T-DNA，目的基因插入T-DNA后构建出 含目的基因的重组Ti质粒（表达载体） 侵染后，将T-DNA转移到被侵染的细胞，再整合到细胞染色体DNA上
动物受精卵
显微注射将目的基因注入其受精卵
原核生物
大肠杆菌…
用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其可吸收周围环境中DNA分子，再将重组的基因表达载体导入
4.目的基因的检测与鉴定
是否稳定维持和表达遗传特性
分子水平
PCR检测染色体DNA上是否插入目的基因/目的基因是否转录出mRNA
设置阴性，阳性，空白对照
从转基因植株/动物/微生物提取蛋白质，抗原-抗体杂交，检测目的基因是否翻译
个体生物学水平
是否有目的性状
从转化产物中筛选目的菌
选择培养基筛选标记基因
