导图社区 分子发光分析法
分子发光分析法，基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，而激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，产生分子发光。
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分子发光分析法
概述
分子发光（Molecular Luminescence）
基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，而激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，产生分子发光。
按激发（excited）的模式分类
光致发光Photoluminescence
荧光 Fluorescence
磷光 Phosphorescence
化学发光/生物发光Chemiluminescence / bioluminescence
热致发光Thermoluminescence
又称热释光。但热能不是用来激发发光，而是释放光能的。
测得的光强对温度的关系曲线称为辉光曲线（glow curve）。
场致发光Electroluminescence
将电能直接转换为光能的发光现象。
摩擦发光Triboluminescence
某些固体受机械研磨、振动或应力时的发光现象。
分子荧光分析法
定义
物质的分子吸收光能后发射出波长在紫外、可见(红外)区的荧光光谱，根据其光谱的特征及强度对物质进行定性和定量分析，这种分析方法就是分子荧光分析法
发展
16世纪发现
到1852年，Stokes导入了荧光是光发射的概念
1867年，高贝尔斯莱德（Goppelsroder）进行了历史上首次的荧光分析工作
20世纪以后，荧光仪器问世，荧光分析方法已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
特点
灵敏度高
取样量少，操作简单
选择性比吸收光谱法好
应用
定性
定量
基本原理
分子发光
基态分子→吸收能量后被激发为激发态→返回到基态时伴随着光子的辐射(Photon radiation)，这种现象被称为“发光(luminescence)”。
激发单重态S与激发三重态T
单重态（ singlet state , S）：两电子具有相反的自旋方向（自旋配对）
三重态（ triplet state , T）：两电子具有相同的自旋方向（自旋不配对）
分子荧光/磷光产生过程
吸收能量→激发→去激(deexcitation)
无辐射去激(Radiationless deexcitation)
振动驰豫（vibrational relaxation, VR）
内部转换（internal conversion, IC）：S→S
系间窜跃（intersystem crossing, ISC）：S→T
外部转移(external conversion, EC)
辐射去激(Radiation deexcitation)
荧光
磷光
荧光和磷光光谱
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，10^-9~10^-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭
π→π*易产生荧光
λ 荧>λ激
从S1→T1要改变电子自旋，发光速度慢，约为 10^-4 ~ 10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间
n→π*易产生磷光
λ磷＞λ 荧>λ激
光谱获得
激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ）
荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值
b.发射光谱的形状与激发波长无关
均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态
c. 镜像规则
荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系
荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率φ
2、荧光与分子结构关系
（1）跃迁的类型
分子结构
①具有大的共轭π键结构
②具有刚性的平面结构
③取代基效应
a、给电子取代基加强荧光
b、吸电子取代基减弱荧光、加强磷光
c、重原子效应
随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，荧光减弱，磷光增强
3、影响荧光强度的外界因素
温度
升高温度碰撞频率升高，荧光效率降低
溶剂
溶剂的极性增大，对激发态会产生更大的稳定作用，致使激发态的能量降低，使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。
溶液pH值
有些化合物在离子状态时不显荧光
内滤光作用和自吸现象
溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光
化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物
溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭
静态猝灭
转入三重态的猝灭
氧的猝灭
自吸猝灭
荧光强度与荧光物质浓度的关系
当荧光效率(Ф)、入射光强度(I)、物质的摩尔吸光系数(ε)、液层厚度(l)固定不变时，且浓度很稀 (A<0.05)时，荧光强度(I)与溶液浓度(C)成正比 I=KC，同样适合磷光
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低，因为公式[ ]中后面部分有影响，有时发生荧光猝灭效应
定量分析方法
校正曲线法
将贮备标准液稀释为所需要的标准系列，用零浓度调仪器零点后，依次由低到高浓度测量标准液的吸光度(或峰高、面积)，同时测定样品和样品空白的吸光度(或峰高、面积)，在坐标纸上以标准液浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
比较法
取已知质量纯荧光物质配成在线性范围内的标准溶液，测出荧光强度I(fs)。然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度I(Fs),分别扣除空白I0根据标准溶液和试样溶液的荧光强度，求出试样中荧光物质的含量
多组分混合物的荧光分析
联立方程法
荧光分析仪器
组成
由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成
①两个单色器
②检测器与激发光互成直角
主要部件
光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽
荧光计中，常使用卤钨灯作光源
荧光光谱仪中常用高压汞灯和氙弧灯
单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱
光谱仪一般采用两个光栅单色器
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长λex
第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长λem
样品池
石英材料的方形池，四面都透光
检测器
光电倍增管
荧光的激发光谱与发射光谱
激发光谱
固定λem，扫描λex
发射光谱
固定λex，扫描λem
分子荧光分析法的应用
无机物分析法的应用
无机化合物与有机试剂形成荧光配合物进行荧光分析法测定
有机物分析法的应用
脂肪族有机分子与某些有机试剂反应后生成能发射荧光的衍生物进行测定
分子磷光分析法
磷光是分子从亚稳的三重态跃迁至基态所产生的光辐射。
当磷光物质浓度很小时（A＜0.05），对于给定物质，当激发光波长和强度一定时，磷光强度只与溶液的浓度有关：Ip ＝Kc
温度对磷光强度的影响
室温下，溶剂分子运动比较剧烈，绝大多数处于三重态的物质分子与溶剂分子碰撞而失活，磷光很难产生。
随温度的降低，分子热运动速率下降，磷光逐渐增强。
室温磷光
向溶液中加入适当的表面活性剂，磷光强度会显著增大，称为胶束增稳室温磷光。
磷光分析仪器
与荧光分析仪器相似，由光源、激发单色器、液槽、发射单色器、检测器和放大显示装置组成。
磷光分析仪器与荧光分光光度计的区别
试样室：试样需要在液氮温度（77K）下分析，以减小猝灭效应的影响。
磷光镜：确保在无荧光的情况下观察磷光，通常采用磷光镜的机械切光装置，利用荧光与磷光寿命的差异消除荧光的干扰。
磷光分析法的应用
与荧光法互相补充，已成为痕量有机物分析的重要手段。
化学发光分析法
1. 化学发光反应
在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。
A +B = C + D* D* → D + hν
（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；
（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当△E=170～300 kJ/mol；位于可见光区；
（3）发光持续时间较长，反应持续进行；
2.化学发光效率
化学效率：
发光效率：
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc/dt 分析物参加反应的速率
化学发光强度与化学发光分析的依据
（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；
（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性
分类
气相化学发光
化学发光反应在气相中进行
a. 一氧化氮与O3的发光反应
b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应
c. 乙烯与O3的发光反应
火焰中的化学发光反应
在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应
一氧化氮
挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。
液相化学发光
化学发光反应在液相中进行
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
生物发光
生物发光是一种特殊形式化学发光，其量子效率和特异性比化学发光强，它发生在生物体系中。生物发光常涉及酶促反应和发光反应，常用生物发光有萤火虫发光和细菌发光。
化学与生物发光分析的应用
优点：
灵敏度极高
仪器设备简单
不需要光源、单色器和背景校正
发射光强度测量无干扰
无背景光、散射光等干扰
线性范围宽
分析速度快
缺点：
可供发光用的试剂少；
发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；
机理研究少。
装置与技术
