基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序，包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基本导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

基因工程的基本操作程序

• 目的基因的筛选与获取
  • 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。如与生物逆抗性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因
    • 筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一
    • 获取方法
      • 基因文库
      • 利用PCR获取和扩增目的基因（特异性）
        • 发明者：穆里斯
        • 原理：DNA半保留复制
        • PCR：是聚合酶链式反应的缩写，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
        • 反应条件
          • 一定的缓冲溶液
            • 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要用Mg²⁺激活
          • DNA模板
          • 分别与两条模板链结合的两种引物
            • 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
          • 四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
          • 控制温度使DNA复制在体外反复进行
        • 扩增过程
          • 目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合
          • 以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸
          • 循环重复，指数形式扩增2ⁿ
            • 变性
            • 复性
            • 延伸
          • 在PCR扩增仪中自动完成，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定
• 基因表达载体的构建
  • 目的基因
    • 只能插在终止子和启动子中间
  • 标记基因
    • 不能在标记基因中插入目的基因，会影响标记
  • 启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，
    • 作用：驱动基因转录出mRNA，最终表达出所需蛋白质
  • 终止子：位于基因下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段
• 将目的基因导入受体细胞
  • 植物
    • 花粉管通道法
      • 可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
      • 或在植物受粉后的一定时间内，减去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入囊胚
    • 农杆菌转化法
      • 转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
      • 农杆菌：能在自然条件下侵染双子叶和裸子，对大多数单子叶无侵染能力 含Ti质粒，能将Ti上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上
      • 不同植物具体操作不同
  • 动物
    • 显微注射法
  • 微生物细胞
    • Ca²⁺处理法
• 目的基因的检测与鉴定
  • PRC技术检测（用来检测目的基因）
• 具体过程
• DNA片段的扩增及电泳鉴定
  • 解释：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。一次PCR要经历30次循环
  • 原理：DNA热变性，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合
  • 电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
    • 琼脂糖凝胶电泳用来鉴定PCR的产物
  • 鉴定：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
  • 重点用具：PCR仪、微量离心管、微量移液器、4种脱氧核苷酸的等量混合液（ATCG）、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA
• 注意温度变化
• 注意事项
• 结果分析