基因工程

一张图系统梳理基因工程的操作工具，基本步骤，筛选方法，理念基础等知识点，全面、准确，是生物等级考的必备工具！

基因工程

• DNA重组技术
  • 分为
    • 动物基因工程
    • 植物基因工程
    • 微生物基因工程
• 理论基因
  • 所有生物共用套密码子
  • 遵循相同的碱基互补配对原则
  • DNA分子结构相同
  • 相同的中心法则
• 成功标志
  • 目的性状成功表达
• 操作工具
  • 限制性核酸内切酶
    • 来源
      • 一般为原核生物
    • 功能
      • 识别特定核苷酸序列
      • 酶切位点
        • 磷酸二酯键
    • 同尾酶
      • 产生相同黏性末端的酶
    • 结果
      • 产生黏性末端
      • 或产生平末端
    • 限制酶的选择
      • 不能破坏目的基因
      • 至少保留一个标记基因
      • 高效性
        • 切两端、不选平末端
        • 不选同尾酶
          • 防止目的基因/质粒环化
          • 防止目的基因反接
  • DNA连接酶
    • 功能
      • 连接相同的黏性末端
    • 酶切位点
      • 磷酸二酯键
  • 运载体
    • 类型
      • 质粒
        • 小型环状DNA分子
      • 病毒
    • 条件
      • 对受体细胞无害
      • 可以自主复制
      • 有多个酶切位点
      • 含有标记基因
        • 一般为两个
          • 便于筛选
        • 类型
          • 抗生素抗性基因
          • 荧光蛋白基因
          • 显色基因
• 基本步骤
  • 获取目的基因
    • 从细胞中直接分离
    • 化学方法人工合成
      • PCR扩增
        • 先解旋
          • 高温解旋
        • 再复制
          • DNA聚合酶要耐高温
      • 逆转录法
  • 目的基因与 运载体重组
    • • 切割质粒时
        • 不能破坏
          • 启动子、终止子
          • 复制原点
        • 质粒保留一个标记基因
          • 便于筛选
          • 如：ampr
            • 氨苄青霉素抗性基因
        • 目的基因
          • 接在
            • 启动子与终止子之间
      • 只用酶BamHⅠ的结果
        • 目的基因环化、质粒自连
        • 目的基因与质粒反接
        • 正常重组
        • 成功率低
      • 用组合酶 BamHⅠ与HindⅢ
        • 不会出现
          • 环化与反接
        • 成功率高
  • 将重组NDA分子 导入受体细胞
    • 动物细胞
      • 方法
        • 显微注射法
      • 受体细胞
        • 受精卵
          • 分化程度低，分裂分化旺盛
          • 全能易表达，易操作
        • 全能干细胞
          • 批量多，易操作
          • 有全能性
      • 优点
        • 可以个体水平
          • 观察性状表达
    • 植物细胞
      • 农杆菌侵染法
      • 常用细胞
        • 愈伤组织细胞
          • 分化程度低，分裂分化旺盛
          • 全能易表达，易操作
    • 微生物细胞
      • Ca2+感受态法
      • 结构简单，操作简便，技术成熟
      • 繁殖快，易培养
  • 筛选含目的基因 的受体细胞
    • 只用A酶
      • 结果
        • 未导入
          • 无抗性基因
        • 导入环化目的基因
          • 无抗性基因
        • 导入空质粒
          • 含两种抗性基因
        • 导入重组质粒
          • 抗青霉素
          • 不抗四环素
      • 影印法（印章法）
        • A中含青霉素
          • 挑选A中的4、6
        • B中含四环素
          • 死亡的4、6
            • 即为成功导入重组质粒的细胞
    • 用A、B组合酶
      • 只需要在培养基中
        • 加入青霉素