HPLC 高效液相色谱法

梳理了高效液相色谱法与经典液相、气相的异同，高效液相色谱仪、检测器、分离类型等相关知识点。

高效液相色谱法

• 概述
  • HPLC
    • 高效液相色谱法（HPLC，high performanceliquid chromatography)于20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。
    • 以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。
    • 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。
    • 优点
      • 灵敏度高、选择性高、分离效能高、分析速度快、操作自动化、应用范围广
      • “三高”，“一快”，“一广”和“一少”
  • 分离原理
    • 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
  • HPLC Vs LC
    • 共同点
      • 与经典液相色谱的工作原理相同，但使用效能却远大于经典的液相色谱;高效液相色谱又被称为现代液相色谱。
    • 不同点
      • (1）高柱效
        • 使用新型高效微粒固定相填料，柱效可达30000块/m理论塔板数;
      • (2）高灵敏度
        • 采用了高灵敏度的检测器
        • 紫外吸收检测器的最小检测量可达10^-9g，而荧光检测器的灵敏度可达10^-11g，非破坏性;
      • (3）分析速度快
        • 采用了高压输液泵
        • 输液压力可达40MPa，流动相流速大大加快，完成一个样品分析，仅需几分钟至几十分钟，与经典的液相色谱相比，分析时间大大缩短;
      • (4）高选择性
        • 不仅可分析有机化合物的同分异构体，使用手性固定相还可分析性质上极为相似的光学异构体。
      • (5) 自动化程度高
    • 三种不同形式液相色谱的特征
  • HPLC Vs GC
    • 共同点
      • （1） 色谱基本理论一致
      • （2） 定性定量分析原理一样
      • （3）可对操作条件、数据处理进行程序控制,自动化程度高。
    • 不同点
      • （1）流动相差异
        • 气体流动相少,液体流动相多, 可供选择范围广。
        • 组分在液相中的扩散系数比在气相中的扩散系数小10^4～10^5倍,与固定相与流动相的作用力不能忽略。
        • GC: 流动相为惰性气体
          • 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用
        • HPLC: 流动相为液体
          • 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用
          • 流动相种类较多，选择余地广
          • 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
          • 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性
      • （2）固定相差别
        • GC多有固定液、粒度粗、成本低、样品容量小；
        • HPLC一般固体吸附剂或化学键合相，粒度小、成本高、样品容量大。
      • （3）分析对象及应用范围更广
        • GC只限气体和低沸点的稳定化合物，15~20％；
        • HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，80~85％以上的物质均可测定。
      • （4）高效液相色谱法一般不破坏样品
      • （5）操作温度
        • GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
      • （6）仪器结构及原理亦有差别
        • 主要为高压输液系统及检测器
    • 与GC相比的缺点
      • (1）缺少像气相色谱法中使用的热导检测器、氢火焰离子化检测器那样的通用型检测器;
      • (2）使用多种溶剂，成本比气相色谱法高，而且易引起环境污染;当进行梯度洗脱操作时，比气相色谱的程序升温操作复杂;
      • (3）不能完成柱效在10万块理论塔板数以上的、组成复杂的样品分析，也不能代替中低压柱色谱去分析受压易分解，变性的样品。
    • 高效液相色谱与气相色谱的比较
  • 影响柱效的因素
    • 基本理论与GC一致，不同点主要由液体与气体流动相的性质差异所引起。
    • 液体不可压缩，扩散系数小（气体的10^5~10^-4），粘度大（100倍），密度大（1000倍）
      • 导致扩散和传质过程差异
    • 液相速率方程
      • H=He+Hd+Hs+Hm+Hsm
        • 涡流扩散项He
          • 降低粒径，提高装填均匀性→提高柱效
        • 纵向扩散项Hd
          • 粘度比气体大得多，扩散系数比气体小得多→可忽略不计
        • 传质阻力项
          • 固定相传质阻力Hs
            • 组分分子从流动相进入固定液中进行质量交换的传质阻力。
            • 改善传质，加快组分在固定相上的解吸过程
              • 液液分配色谱
                • 薄的固定液层
              • 吸附、排阻、离子交换
                • 小粒径填料
              • 化学键合相
                • 可忽略
          • 流动相传质阻力Hm
            • 流动相经过固定相颗粒时，处于边缘的分子与固定相的作用大于处于流路中心的分子，引起峰展宽
            • 大小取决于色谱柱内径和填料颗粒的结构
            • 改善途径
              • 采用小粒径填料
              • 减小柱空间
          • 滞留流动相传质阻力Hsm
            • 一些流动相会滞留在固定相颗粒的孔内，不同分子在滞留的流动相中扩散距离不同，从孔内出来的速度不同，造成峰展宽。
            • 采用颗粒小、微孔浅、孔径大的载体
    • 提高柱效的一般措施
      • 缩短进样时间
      • 使用细粒径填料
      • 改善传质过程
      • 减小检测器死体积
• 高效液相色谱仪
  • 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理显示系统
  • 仪器基本结构
    • • (一)高压输液系统 High pressure delivery system
        • 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器、脱气装置、梯度洗脱装置、废液缸等组成。
        • 作用
          • 提供足够恒定的高压，迫使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相
        • 构成
          • 1、流动相储存及脱气装置
            • （1）Mobile phase storage 贮液器
            • （2） Mobile phase degassing流动相脱气装置
              • 作用
                • ①防止在洗脱过程中，当流动相由色谱柱流入检测器时因压力降低而产生气泡。
                • ②消除溶解在流动相中的氧的影响。
              • 装置
                • ①离线超声波振荡脱气；
                • ②在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；
                • ③在线真空脱气。
          • 2、高压输液泵Pump
            • 恒流泵
              • 在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；
              • 恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
                • 单柱塞
                • 双柱塞
                • 隔膜泵
              • 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。
            • 恒压泵
              • 能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。
              • 主要用气动放大泵
              • 泵腔体积大，流量随外界阻力改变，不适合梯度洗脱
            • 几种输液泵的基本性能
          • 3、梯度淋洗装置 gradient elution
            • 目的：为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离
            • 操作：液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。
            • 梯度洗脱装置的作用：就是解决溶液的混合问题(Mobile phase mixing ), 其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。
            • 操作方式
              • 线性梯度
                • 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。
              • 阶梯梯度
                • 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。
                • 高压梯度
                  • 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的
                  • 优点：只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。
                  • 缺点：使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。
                • 低压梯度
                  • 只需一个高压泵，泵前安装了一个比例阀，混合在比例阀中完成。
                  • 比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。
                  • 特点
                    • 用单泵产生梯度，泵前混合
                    • 脱气要求高
                    • 不易调节梯度的滞后体积
      • （二）进样系统 Sample Injection System
        • HPLC柱比GC柱短得多(约5～30cm), 所以柱外展宽(又称柱外效应)较突出。主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。
        • 分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此HPLC法中对进样技术要求较严。
        • 进样器
          • （a）隔膜进样: 用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零。
          • （b）Rotary sample loop injector 高压定量进样阀
          • （c）autosamplers自动进样器
      • （三）分离系统Separation system
        • 色谱柱: 不锈钢柱, 固定相
        • 按用途分为分析型和制备型
        • 固定相
          • ① 硅胶：极性吸附剂
          • ② 键合固定相
            • a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C
            • b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
              • 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
            • c. 硅碳键型： ≡Si—C
            • d. 硅氮键型： ≡Si—N
      • （四）检测系统Detection Systems
        • 光学检测器：紫外－可见光、荧光、红外、二极管阵列检测器、质谱等。
        • 电学检测器：库仑、电导检测器等。
      • （五）记录和数据处理系统
        • 色谱工作站
• 液相色谱检测器
  • 要求：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。
  • 分类:
    • 溶质型检测器
      • 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应
      • 紫外、荧光、电化学检测器等
    • 总体检测器
      • 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应
      • 示差折光，电导检测器等
  • 1、紫外检测器 Ultraviolet absorption detector, UVD
    • HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。
    • 特点：①灵敏度高；②线形范围高；③流通池可做的很小(1×10mm, 容积 8μL)；④对流动相的流速和温度变化不敏感；⑤波长可选，易于操作；⑥可用于梯度洗脱。
  • 2、荧光检测器 Fluorescence Detector, FD
    • 高灵敏度、高选择性
  • 3、示差折光检测器 Differential Refraction Index detector, RID
    • 通用型检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器
    • 凝胶色谱、制备色谱的必备检测器
    • 主要缺点：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能用于梯度淋洗。
  • 4、蒸发光散射检测器 Evaporative light scattering detector, ELSD
    • 蒸发型质量检测器。(不符合朗伯－比尔定律）
    • 通用型检测器
  • 5、电化学检测器 Electrochemical detector, ECD
    • Conductometric detector (电导检测器)
    • Amperometric detector (安培检测器)
    • coulometric detector (库仑检测器)
    • Polarographic detector (极谱检测器)
    • 伏安检测器 Volt-ampere detector
    • Dielectric constant detector(介电常数检测器)
    • potentiometric detector (电位检测器)
    • 特点
      • 伏安检测器用于具有氧化还原性质的化合物的检测;
      • 电导检测器主要用于离子的检测.
      • 安培检测器(AD)应用最广泛.
      • ECD灵敏度很高,尤其适用于痕量组分分析;缺点是干扰比较多,电极寿命有限,对温度和流速的变化比较敏感.
      • 适用范围广,凡具有氧化还原活性的物质都能进行检测,本身没有氧化还原活性的物质经过衍生化后也能进行检测.
  • 6、 质谱检测器 Mass spectrometry detector, MSD
    • 优点: 灵敏度高，选择性好，能同时给出组分的结构信息。
    • 缺点: 响应信号受离子化效率限制，仪器较为昂贵，通常需专人使用与维护。
    • 适用范围: 组分的结构鉴别，微量及痕量组分的分析，药物代谢分析等。
  • 几种检测器的性能比较
• 高效液相色谱的类型
  • 一、液-固吸附色谱法 Liquid-solid adsorption chromatography, LSC
    • 原理： 基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。
    • Mobile Phase: Liquid (less polar mobile phase)
    • Stationary phase: Sorbent (吸附剂）
    • 分离机理：基于样品极性的差异。
    • 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。
    • 缺 点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾。
    • 适用分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性.
  • 二、Liquid-liquid partition chromatography ( LLPC, 液-液分配色谱法) and chemically bonded phase chromatography (CBPC, 化学键合相色谱法）
    • 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
    • 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；即基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。Partition of solutes in two phases based on the difference of their relative solubility.
    • 流动相：对于亲水性固定液, 采用疏水性流动相, 即流动相的极性小于固定液的极性(正相normal phase); 反之, 流动相的极性大于固定液的极性(反相reverse phase)。
    • 固 定 相：早期涂渍固定液, 固定液流失, 重现性差, 现较少采用;
    • 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。
    • 分类
      • 正相键合相色谱法 Normal phase HPLC: nonpolar solvent/polar column
        • 由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。早期的液相色谱中曾广泛采用这种体系。
        • 对于一些在非极性疏水固定相中强烈保留的有机分子常常采用正相HPLC模式。
        • 主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。
      • 反相键合相色谱法 Reversed phase HPLC: polar solvent/nonpolar column
        • 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。
        • 是当前液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。
        • 反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。
  • 三、离子交换色谱法 Ion Exchange Chromatography, IEC
    • 固 定 相：低交换容量的离子交换树脂；带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可用于阴离子的分离。
    • 流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；
    • 基本原理：利用固定相中离子交换基团与组分离子的交换能力的不同而达到分离的液相色谱。组分在固定相上反复的发生离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；
    • 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。
  • 四、离子色谱法 Ion Chromatography, IC
    • 在IEC中，强电解质流动相在电导检测器上产生强的背景信号，严重干扰待测组分离子的检测。
    • 20世纪70年代中期，IC在IEC基础上发展起来了。
    • IC与IEC的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
  • 五、其它离子色谱法
    • ① 离子对色谱法 Ion Pair Chromatography, IPC
    • ② 离子排斥色谱法 Ion Exclusion Chromatography
    • ③ 离子抑制色谱法 Ion Suppression Chromatography
  • 六、尺寸排阻色谱法 Size exclusion Chromatography, SEC
    • 原理： 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。
    • 样品分子与固定相之间不存在相互作用力（吸附、分配和离子交换等），因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。
    • 流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。
  • 七、 亲和色谱法 Affinity Chromatography, AC
    • 定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。
    • 固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得。
  • 八、色谱类型选择 Guide to selection to HPLC mode
    • 一看大小，二看电荷，三看极性