重组DNA技术的基本工具

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重组DNA技术的基本工具

• 定义
  • 基因重组
    • 类型
      • 减Ⅰ前期：同源染色体非姐妹染色单体互换
      • 减Ⅰ后期：非同源染色体非等位基因自由组合
      • 基因工程操作
    • 特点
      • 与诱变育种比：定向改造遗传特性，目的性强
      • 与杂交育种比：打破生殖隔离；周期短
    • 理论基础
      • 复制
        • 原料相同：4种脱氧核苷酸
        • 原则相同：碱基互补配对原则
        • 结构相同：都是双螺旋结构
      • 转录翻译
        • 共用一套密码子
        • 基因是控制性状的基本结构单位
• 分子手术刀
  • 定义
    • 限制性内切核酸酶→限制酶
  • 来源
    • 主要从 原核生物 中分离纯化
  • 作用
    • 作用于磷酸二酯键，识别回文序列并剪切
  • 特点
    • 专一性
      • 特异性识别
        • 不同酶识别序列不同，但可以产生相同末端
      • 特定位点切割
  • 结果
    • 粘性末端、平末端
  • 应用
    • 原核生物易受到DNA入侵，限制酶可以剪切以保证自身安全
      • 自身DNA不被剪切
        • 无识别序列
        • 被修饰
    • 双酶切
      • 产生不同黏性末端
        • 避免
          • 目的基因自身环化
          • 目的基因反向连接
      • 产生同种黏性末端
        • 作用
          • 酶切位点可选择范围增大
          • 避免目的基因本身被切断
• 分子缝合针
  • 定义
    • DNA连接酶
  • 作用
    • 恢复 被限制酶切断的 磷酸二酯键
  • 种类
    • E.coli DNA连接酶
      • 来源：大肠杆菌
        • 黏性末端
    • T4 DNA连接酶
      • 来源：T4噬菌体
        • 黏性+平末端
• 分子运输车
  • 定义
    • 载体
  • 种类
    • 质粒--人工改造加入抗性基因便于重组DNA的筛选
      • 细胞核外能 自我复制 的环状双链DNA
    • 动植物病毒
    • λ噬菌体的衍生物
  • 条件
    • 有复制原点、启动子、终止子
    • 可以自我复制/整合到受体DNA上
    • 有≥1个酶切位点
    • 对受体细胞无害
• DNA的粗提取与鉴定
  • 原理
    • 粗提取
      • DNA、蛋白质、脂质物理和化学性质不同
        • DNA不溶+蛋白质溶于酒精
        • DNA在NaCl溶解度不同 2mol/0.14mol/L→max/min
    • 鉴定
      • 二苯胺（现配现用）+DNA→蓝色溶液≠沉淀
  • 操作
    • +研磨液
      • 破坏细胞膜
      • 溶解 保护DNA
    • 纱布过滤
      • 直接离心
      • +预冷的酒精
        • 抑制分子热运动降低溶解度
        • 抑制核酸水解酶的活性
        • 增加DNA柔韧性 减少断裂
    • 玻璃棒沿一个方向搅拌，取丝状物溶于NaCl溶液+二苯胺
      • 沸水浴