SIReg3g的日表达与核心CC基因网络无关，需要饮食诱导的肠道微生物群
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核心生物钟基因（CC基因）：饮食和肠道微生物状态都没有影响粘膜刮屑中核心CC基因的昼夜节律性和振幅
抗菌肽转录水平：rc-SPF小鼠在特定ZTs中的转录水平显著增加，特别是在REG3家族成员中，包括Reg3g和Reg3b，其他没有显著差异，比如LYZ1
补充材料：与Reg3g相关的Muc2，在ZT10时rc-SPF小鼠中也显著升高
翻译水平：（方法：免疫染色）：rc-SPF组中观察到类似的REG3g日变化模式，但SPF-hf组中没有，而通过LYZ1的免疫染色，表达水平或振荡水平没有明显的差异
方法：western blot：发现了饮食和zt（时间）依赖的REG3γ振荡
只有RC喂养小鼠1-8部分表现出zt依赖的Reg3g表达，而在RC-或hf喂养的小鼠中，ZT2和10的隐窝表达没有差异(图1F)
补充材料：Reg3g同时由吸收性肠上皮细胞和Paneth细胞表达，用标记基因蔗糖酶-异麦芽糖酶（绒毛上皮标记物）和Lyz1(Paneth细胞标记物)来确认细胞组分的组成。1-8组分含有吸收性肠上皮细胞，组分9含有隐窝(包括Paneth细胞)。
1、微生物状态或饮食如何，核心CC基因网络都是稳定的；
2、绒毛上皮细胞内宿主Reg3g表达的昼夜节律是由肠道微生物的存在驱动的，包括饮食选择的微生物
高脂肪饮食改变了回肠微生物群落成员，并抑制了微生物相对于常规食物的日振荡
HF显著增加了属于厚壁菌门的相对丰度，减少了拟杆菌门。
方法：定时对回肠远端腔内容物进行16SrRNA基因扩增子测序和微生物生态学定量分析(QIIME)。
用Bray-Curtis进行beta多样性分析显示，RC和HF微生物群落之间存在显著差异(表S3)
补充材料：主坐标分析[PCoA])和堪培拉距离也显示RC和HF微生物群落之间存在显著差异(表S3)
尽管16SrRNA基因拷贝数在RC-和HF喂养的小鼠中表现出相似的振幅，但HF引起了相对于RC的相移(图2C)。
补充材料：通过qPCR测定的ZT中平均16SrRNA基因的绝对拷贝数在RC和HF之间没有差异(图S2C)
RC-和HF喂养的小鼠之间观察到明显的OTU差异(图2D)，其中相对于RC，HF显著增加了梭状芽孢杆菌门目，减少了拟杆菌门目(表S2)。
通过eJTK确定的振荡和非振荡的OTUs的百分比（饼状图），以及唯一的和共享的振荡OTUs的数字（维恩图）。15%的回肠类群在RC下振荡，并被HF显著降低。
在RC喂养的小鼠的管腔内容物中共观察到81个独特的振荡OTUs，而在HF喂养的小鼠中存在14个独特的OTUs；在RC和HF中，只有两个振荡的OTUs重叠(表S4)。
在HF条件下，注释到属的的振荡相比RC OTUs缺失、总体丰度下降或失去振荡(图2F)。
尽管HF中振荡OTUs的百分比下降，但仍有一些患者获得了振荡(图S2D)。两个在RC和HF下均出现振荡的otu被注释为瘤胃球菌属和示波螺旋菌属。它们的总体丰度受到饮食的影响(图S2E；表S4)。
1、HF显著改变了远端回肠微生物丰富度
2、HF选择了一组相对独特于RC的振荡类群
3、尽管HF振荡OTUs总体减少
饮食促进的特异性类群与远端SI日变化的Reg3γ表达相关
Pearson相关分析结果显示，RC-和hf-喂养小鼠的腔内内容物中只有3个OTUs与Reg3γ的表达显著相关。乳酸菌OTU与Reg3g的表达呈正相关，而梭状芽孢杆菌科和肽链球菌科的OTUs的表达呈负相关(图2G)。
尽管与Reg3g负相关的OTUs在RC-或HF喂养的小鼠中没有振荡，但相对于RC，它们在所有ZT中的相对丰度都显著增加(图2H)。
梭状芽孢杆菌科、乳酸菌科和胃链球菌科的相对丰度与Reg3g的表达呈几乎相同的正相关和负相关(图2I)。
补充材料：仅在RC中，乳酸菌科在中晚期暗周期中增加，而在hf喂养的对应物中，梭状芽孢杆菌科和肽链球菌科在几个ZTs中显著增加(图S2F)。
1、乳酸菌科通过RC富集并表现出振荡
2、而特异性的乳酸菌OTUs与宿主的日Reg3g表达呈正相关。
3、HF喂养减少微生物振荡，促进梭状芽孢杆菌科和胃链球菌科的整体扩张，这两种科都与Reg3g的表达呈负相关。
饮食诱导的复杂肠道菌群或单个菌株直接影响Reg3g的体外表达
在ZT10时，与HF裂解液相比，SPF小鼠回肠腔内的裂解液暴露24h后诱导了WT小鼠肠样细胞中Reg3g的表达。
方法：以鼠李糖乳杆菌GG(LGG，乳酸菌科)、厌氧胃链球菌（梭状芽孢杆菌科P. stomatis）和口胃厌氧杆菌(LGG，口胃链球菌科)为条件培养基。
结果：肠样物质暴露于LGG条件培养基中12小时后，可显著诱导Reg3γ的表达(图3B)。
我们观察到单独使用LGG可以诱导Reg3g的表达，而单独使用P. stomatis则没有诱导。即使在LGG存在的情况下，共同暴露于肠样杆菌也能抑制Reg3g的诱导。这些数据表明，无论是否暴露于诱导条件培养基中，由HF选择的细菌对Reg3g的表达都具有抑制作用。
目的：为了检测LGG或P. stomatis是否需要MyD88信号来影响Reg3g的表达（文献来源）
方法：将SPFMyD88+/或MyD88/同窝小鼠的肠样暴露在不同的细菌条件培养基中。
结果：LGG在MyD88+/-，中显著诱导了Reg3g，而在MyD88-/-中没有诱导；无论MyD88状态如何，P. stomatis对均没有诱导(图3D)。
结论：LGG需要MyD88
目的：为了进一步阐明LGG-或P. stomatis来源的小分子是否会差异地影响Reg3g的表达，
方法：对条件培养基进行了大小分馏(图3E)。
结果：由LGG衍生的小于3kDa的小分子足以诱导Reg3g的表达，而P. stomatis对所有含有小于30kDa的小分子的组分均有明显的抑制作用
结论：LGG衍生的小分子诱导Reg3g，而P. stomatis衍生的小分子则以myd88依赖的方式抑制Reg3g的表达。
目的和方法：测试3kDa lgg条件培养基部分的热处理是否会影响其诱导Reg3g表达的能力。
结果：在SPF-WT小鼠的肠样细胞中，与未处理的3kDa分离的LGG相比，热处理导致诱导Reg3g的能力降低了30%-40%(图3F)
1、LGG衍生的小分子是热不稳定
2、菌株特异性化合物可能是诱导Reg3g所必需的
饮食诱导的革兰氏阳性菌对REG3g具有独特的抗性d
子主题
补充材料
目的：确定REG3g是否对几种具有代表性的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌表现出不同的杀菌作用：包括口孢杆菌、LGG和罗伊氏乳杆菌
结果：革兰氏阴性菌对rREG3g有耐药。L. reuteri在下降与P. stomatis相似，而LGG仅在低浓度时表现敏感，在高rREG3g浓度下表现抗性(图S3A)。
结论：说明饮食诱导的细菌可能对REG3γ具有独特的敏感性，进一步揭示了相对于其他革兰氏阳性细菌，只有某些乳酸杆菌可能对REG3g的抗菌特性具有耐药性。
来自LGG的小分子可以独特地诱导Reg3g的表达，而不是所有的乳酸菌都能普遍产生
3kDa罗伊氏乳杆菌相对于3kDaLGG表现出诱导Reg3g表达的能力降低(图S3B)。
为了进一步表征和区分LGG和罗伊氏乳杆菌产生的独特小分子，我们接下来通过3kDa的LC-MS/MS和热处理的条件培养基进行了质谱分析(图3G)
3kDa的罗伊氏乳杆菌相对于未处理和热处理的3kDaLGG都表现出独特的特征
差异和折叠变化(FC)分析(p1)显示：859年独特的小分子差异，3kDa未经处理与热处理LGG；而3kDaLGG和3kDa罗伊氏乳杆菌显示1439独特的不同特性，之间的重叠为149(图3H)。
火山图显示，未处理LGG3kDa与热处理LGG（7.51–6.88）之间的小分子丰度降低，而3kDaLGG与3kDa罗伊氏乳杆菌显示出更大的FC（10.69–9.88）(图3I)。
说明这表明LGG和罗伊氏乳杆菌之间的小分子谱的差异比LGG热处理后观察到的差异更大。
相对于LGG3kDa，阳性和阴性fc含量最高的前25个差异丰富的分子见表S5。虽然许多代谢物的身份尚不清楚，但也有一些被鉴定为支链氨基酸(表S5，蓝色突出显示)。A
虽然目前尚不确定是哪些特定的小分子驱动了Reg3g表达的诱导或抑制，但这些数据表明，每种细菌的Reg3g表达谱存在显著差异
回肠远端Reg3g表达具有乳酸菌株的特异性，并受饮食组成的影响
为了转化我们的体外研究结果，我们将RCfed-GF小鼠与具有独特诱导Reg3g表达能力的乳酸菌株以及对REg3g的抗菌特性具有独特耐药性的菌株，即LGG和罗伊氏乳杆菌进行单关联(图3J)。
仅在ZT10（预期的表达峰值）收获的LGG-单相关小鼠的回肠黏膜擦伤中，Reg3g的表达显著增加，而在GF对照或罗伊氏乳杆菌-单相关小鼠中没有观察到。只有LGG-单相关小鼠表现出Reg3g振荡，而在所有3个zt中，GF和罗伊氏乳杆菌-单相关小鼠中观察到低且恒定的表达水平。
补充材料：有趣的是，与GF-和LGG-单相关者相比，罗伊氏乳杆菌单相关者导致患者在4周内体重显著增加，尽管性腺脂肪垫重量没有显著差异(图S3C和S3D)。
补充材料：LGG-单相关小鼠及其GF对应小鼠分别喂食RC或HF。与LGG-RC相比，LGG-HF在关联后的3周和4周导致了适度但显著的体重增加(图S3E)。
与GF-RC相比，GF-HF和LGGRC小鼠的性腺脂肪均显著增加(图S3F)。
1、在ZT2和10(rc喂养的SPF小鼠表达最低和峰值)，Reg3g的表达仅在LGG-RC的回肠黏膜擦伤中显著增加，而LGG-HF小鼠没有变化
2、Lyz1的表达仅在LGGRC小鼠中增加(图S3G和S3H)。
饮食组成和特定细菌，直接影响日间回肠远端Reg3g，与宿主代谢结果的变化相对应。
REG3g缺乏不影响小肠核心CC基因的表达，促进饮食依赖性葡萄糖耐受
饮食或遗传背景不影响CC的总体和日表达，进一步支持了核心CC基因网络和Reg3g之间的独立性(图S4A；表S1)。
在RCReg3g+/小鼠中，Reg3g表达显著升高且日升高，在ZT10达到峰值，而在Reg3g/小鼠中未检测到转录本(图4A)。
补充材料：饮食或基因型对Crypt4、Lyz1、Ang4和Tlr的表达水平、昼夜节律或幅度没有影响(图4A和S4B；表S1)。
rc喂养的Reg3g+/小鼠表现出Muc2表达的整体水平和日变化模式增加，在ZT10反映Reg3g时达到峰值；然而，在hf喂养的Reg3g+/以及RC和hf喂养的Reg3g-/小鼠中，Muc2表达减少且心律失常(图S4C)。
Reg3g和其他amp独立于核心CC，而Reg3g似乎介导了饮食对Muc2表达和节律性的影响
与Reg3g+/同窝小鼠相比，Reg3g-/-小鼠对HF饮食诱导的肥胖同样敏感，在4周内，与rc喂养的小鼠相比，体重增加了12%(图4B)。
补充材料：肝脏重量没有差异，而HF显著增加了性腺和肠系膜脂肪，无论遗传背景如何(图S4D)
1、与rc喂养的Reg3g+/-对照相比，rc喂养的Reg3g-/小鼠表现出明显更差的葡萄糖耐受，葡萄糖清除率较慢，曲线下面积(AUC)增加。
2、而HF的血糖清除率降低，无论相对于rc喂养的Reg3g+/小鼠(图4C)。
REG3g不会改变HF饮食诱导的肥胖结果，但可能在饮食如何影响糖耐量方面发挥功能性作用。
高脂肪饮食抵消了REG3g对回肠微生物群的适度影响，并改变了与REg3g表达相关的特定细菌家族
补充材料：无论基因型如何，HF显著增加了厚壁菌门的相对丰度，拟杆菌门的丰度相应减少，放线菌的丰度略有变化(图S5A)。
变形菌门、蓝藻菌门和软神经菌门的相对丰度没有发现差异（数据未显示）。这在超过门水平的更高的分类学分辨率上也很明显(图S5B；表S2)。
使用Bray-Curtis距离进行的beta多样性分析显示，无论腔内含量的基因型如何，HF的群落成员度都发生了变化(图5A；表S3)
在基因型之间观察到群落成员的显著差异，但仅在喂食RC时，表明饮食依赖的基因型效应(图5B，左图)，这被HF消融(图5B，右图)。
补充材料：我们进一步探讨了饲粮与REG3g对家族水平的腔内含量微生物群落成员的影响。HF导致乳酸菌科的相对丰度降低，而肽链球菌科和梭状芽孢杆菌科的数量增加，无论基因型如何(图S5C)。
与rc喂养的Reg3g+/小鼠相比，hf喂养的Reg3g/的乳酸菌科相对丰度降低，而在rc喂养的小鼠中，肽链球菌科和梭状芽孢杆菌科在几乎所有的ZTs中都有所降低，无论基因型如何(图5C)。
饮食广泛地重塑了回肠远端微生物，具有REG3g的适度和饮食依赖效应。
Reg3g缺乏与HF结合，促进了对Reg3g杀菌作用敏感的梭状芽孢杆菌和细菌的振荡增加
虽然16SrRNA基因拷贝数在各组间没有差异，但昼夜节律性仅在rc喂养的reg3g-/小鼠中明显(图S5D；表S1)。
通过eJTK对腔内内容物的16SrRNA基因扩增子测序进行检测，发现不同基因型间特定类群的振荡存在饮食依赖性差异(图S5B；表S4)。
我们观察到rc喂养的Reg3g+/小鼠比hf喂养的小鼠表现出更多的振荡OTUs，而两个Reg3g/饮食组表现出几乎相同的数量(图S5E，左面板；表S4)。粘膜刮伤表现出相反的模式，其中Reg3g/小鼠表现出更多的振荡OTUs，无论饮食如何(图S5E，右面板)。
相对于所有其他类群，在管腔内内容物的顺序水平上，振荡类群的多样性最高(图6A，左面板；表S6)。在Reg3g+/小鼠中，与rc喂养的对照组相比，HF导致振荡的乳酸杆菌和梭状芽孢杆菌减少。然而，在Reg3g/小鼠中，HF减少了振荡的拟杆菌目，同时振荡的梭状芽孢杆菌目也增加了(图6A，左面板；表S6)。我们观察到，粘膜刮伤相对于管腔内内容物表现出独特的OTU振荡特性(图6A，右面板；表S6)。无论基因型如何，RC的振荡OTUs相对于管腔内含量的多样性要少得多(图6a；表S6)。
无论饮食如何，Reg3g/小鼠相对于Reg3g+/小鼠也表现出最多的振荡拟杆菌目和梭状芽孢杆菌数量。
许多振荡的乳酸杆菌OTUs在rc喂养的小鼠中表现出相对丰度的增加，无论基因型如何(图6B)。
特异性无病原体 specific-pathogen-free (SPF)
无菌 germ free (GF)
计时器时间点Zeitgeber time points(ZT)
再生胰岛衍生蛋白3伽马 Regenerating islet-derived protein gamma（Reg3g）
一个核心生物钟 a core circadian clock(CC)
高脂饮食 high-fat (HF) diet
常规食物 regular chow (RC) diet
抗菌肽 antimicrobial peptide (AMP)
操作分类单元 operational taxonomic units(O TUs)
