导图社区 第7章 干细胞与组织工程
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第7章 干细胞与组织工程
干细胞与组织工程知识总结，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。胚胎干细胞简称ES(Embryo stem)细胞，是一种全能干细胞,是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。
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第7章 干细胞与组织工程
干细胞
定义：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
干细胞有几个主要特征 干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。 1. 干细胞本身不是终末分化细胞；能无限增殖分裂； 2. 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；
1.自我更新
(1)对称分裂（symmetric division）是指一个干细胞分裂产生的两个子细胞全是干细胞。
(2)不对称分裂（asymmetric division）是指一个干细胞分裂成一个干细胞和一个短暂增殖细胞，称之为祖细胞（progenitor cell)。祖细胞分裂形成的是两个专一功能的子细胞，不具备自我复制的能力。
2.增殖
（1）增殖的缓慢性：一般情况下，干细胞处于休眠或缓慢增殖状态。缓慢增殖还可以减少基因发生突变的可能性。
（2）增殖的自稳性：也称自我维持，是指干细胞会 自我更新维持自身数目的恒定，主要是通过不对称分裂来实现。(英国爱丁堡大学与新加坡研究人员发现，维持胚胎干细胞多功能性的关键蛋白Oct4水平下降时会诱发胚胎干细胞进行自我更新，从而使干细胞数量保持在一个均衡状态。在人类胚胎干细胞细胞膜上有一种“现在进行分裂”信号，这种信号的位置能调控细胞平面分裂开始的位置，也决定了两个子细胞中哪一个将保持干细胞特性。)
3.分化特征
（1）单能干细胞（Monopotent stem cell)：是只能分化为单一类型细胞的干细胞。
（2）多能干细胞（Multipotent stem cell）：是能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。
（3）全能干细胞（totipent stem cell）：是具有无限分化潜能的干细胞。例如胚胎干细胞。
影响分化的因素① 药物（毒性）的影响：确定环境因素如何通过影响干细胞而影响个体的生长（缺陷如何产生） ② 发育及机制与调控的研究：细胞培养—组织—细胞治疗，如糖尿病（分泌不足或受体不响应）
1998分离得到人的胚胎干细胞和胚胎生殖细胞
干细胞的分类
按分化潜能
全能干细胞（ Totipotent stem cell）： 它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞、胚胎生殖细胞。
多能干细胞（ Multipotent stem cell），具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞 。
专能干细胞（ Monopotent stem cell），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
根据来源
来源于胚胎
胚胎干细胞 ESC （来源于内细胞团）（Embryonic Stem Cell ）
胚胎性生殖细胞 EGC （来源于原始生殖细胞）（Embryonic Germ Cell ）
来源于成体
成体组织来源的干细胞 ASC（专能or单能）（Adult-derived Stem Cell ）
根据干细胞组织发生的名称
胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 视网膜干细胞：视网膜脱落，剧烈运功，无免疫性 胰腺干细胞
胚胎干细胞
定义：胚胎干细胞简称ES(Embryo stem)细胞，是一种全能干细胞,是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。
ES细胞生物学特性
1.细胞形态结构及核型
① 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。
② ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与 ICM细胞有差异。
③ 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。
④ ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。
⑤ ES细胞增殖迅速，每18—24 h分裂增殖 1次。
⑥ 此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。
维持未分化状态的胚胎干细胞生长群落特征——鸟巢状
2.细胞的高度分化潜能
ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点
1. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。
2. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”---“囊状胚体”---细胞分化物。
3. ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞 *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。
ES细胞的全能性主要体现在如下方面
①形成畸胎瘤：将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；
②形成类胚体：培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织；
③直系分化：通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；强制ES表达MyoD，ES将发育为肌肉细胞。若为主控基因，ES则发育为其控制的类型
④形成嵌合体：将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。 （knock out 必须先找到嵌合体）
胚胎干细胞的体外定向诱导分化
胚胎干细胞诱导分化的途径（目标：定向分化）
拟胚体（Embryoid body）的形成：在无饲养层系统中培养的ES细胞在体外可以形成拟胚体，拟胚体包含三个胚层来源的细胞，并能分化出三个胚层的细胞。
非拟胚体形成途径
3.碱性磷酸酶的表达
① AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。
② 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。
③ 猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。
4.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达
SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。 *早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA－1）。 *在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA-1的表达。 *小鼠SSEA-1的表达自8-细胞期开始，直到原始外胚层形成期。 *早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。
胚胎干细胞的建系
分离
从早期胚胎内细胞团（Inner cell mass, ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。ES细胞一般是指该途径分离到的胚胎干细胞。
方法
免疫学方法：表面标志物 免疫外科学方法：囊胚腔对抗体的不通透性 组织培养法：将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床 显微外科学方法：仪器与技术要求高
流程
（1）细胞团获得（引起争议之处） （2）原代培养 （3）传代培养（建系） （4）鉴定（干细胞、分化潜能）
培养
有饲养层培养法
*主要应用小鼠胚胎原代成纤维细胞（PMEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养层细胞。 *PMEF和SIM都能分泌促进胚胎干细胞增生和抑制胚胎干细胞自主分化的因子—白血病抑制因子（LIF）。 *白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF），一种天然细胞因子，因可以抑制白血病细胞系M1的生长和分化而得名。
无饲养层培养法
是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或者在基础培养基加入重组的LIF等细胞因子制备成条件培养基。保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态。 除LIF外，细胞因子还有： 碱性成纤维生长因子（Basic fibroblast growth factorb, FGF），是一种与肝素结合的多肽类丝裂原（mitogen），重要的细胞增殖与分化调节剂。 有研究发现无血清培养基中添加人的碱性成纤维生长因子（bFGF）利于保持胚胎干细胞的未分化状态。
ES细胞的鉴定
细胞的形态结构
初步鉴定指标： 形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁） 生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）
核型分析
ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验
碱性磷酸酶（AKP）染色
碱性磷酸酶（Alkaline phosphatases, AKP）活性：未分化的胚胎干细胞中含有丰富的碱性磷酸酶，活性很高；而已经分化的胚胎干细胞中碱性磷酸酶呈现弱阳性或阴性。 *常用快绿（Fast Green Staining)染色法 *对照以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照 *作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。 *结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为阳性。
干细胞标记物
*位于细胞表面可以有选择性地结合和粘附信号分子的受体蛋白。 *例如：胚胎干细胞为未分化细胞，能表达早期胚胎细胞的阶段特异性胚胎抗原（Stage-specific embryonic antigen，SSEA）。 *灵长类ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4及高分子糖蛋白TRA-1-60、TRA-1-81等。
SSEA-I 免疫荧光标记
• 第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。 • 步骤： ①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20 min； ②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min； ③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液； ④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min； ⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。 • 样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞是否出现荧光作出判断。
分化能力检测
体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成 核移植
端粒酶（Telomerase）活性
端粒酶是增加染色体末端端粒序列、维持端粒长度的一种核糖蛋白。 端粒酶有助于维持端粒长度，胚胎干细胞有着高水平的端粒酶活性，并具有长的端粒。
胚胎干细胞分化潜能评价
（1）体外分化实验：将获得的胚胎干细胞制成 悬浮液培养在铺有明胶的培养皿中，一段时间后部分细胞贴壁生长，分化成神经、肌肉、软骨等不同细胞。 （2）体内分化实验：将一定量的胚胎干细胞注射进同源动物皮下，有组织瘤生成。 （3）嵌合体形成：将胚胎干细胞通过聚集法或者注射法与受体胚胎结合，并且将胚胎移植进同期化代孕母受体，各自表达自己的基因型，最终得到嵌合体动物。
胚胎干细胞的制备
直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法，这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响分离ES细胞的效率。
卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到胚胎干细胞。
胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序： 获得功能基因 构建基因打靶载体 转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系 制备嵌合体 筛选进入生殖系小鼠 转基因小鼠（F1）表型分析 选择单系同胞交配产生（F2）代 筛选纯合子的转基因小鼠
• 目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能性，因此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。 • ES细胞的分离 早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取 • 分化抑制物的选择 饲养层（feeder lopr） 条件培养基（conditioned medium， CM） 分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA）（细胞培养物；B27） • 基础培养基的选择、添加物的选用
目前胚胎干细胞的研究
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）也可被称为多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。 • 其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。
ES细胞的应用前景： （1）揭示人及动物的发育机制及影响因素 （2）药学研究方面 （3）在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用：用人类胚胎干细胞培育出卵子 （4）在转基因动物中的应用：制备嵌合体动物
面临的难题： 增殖与分化的矛盾，体外培养ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态 潜在致癌机制，ES 细胞高度未分化 器官形成困难重重，ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破 伦理冲突
成体干细胞
定义：是存在于成体动物的许多组织和器官，具有修复和再生的能力的未成熟细胞，大多数时候处于静息状态。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。
成体干细胞来源
已经报道的含有干细胞的成体组织包括：脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏。 神经干细胞：神经系统，分化成神经元、胶质细胞。 造血干细胞：骨髓造血干细胞、脐带血造血干细胞。 间质干细胞：骨髓、脐带血、脂肪等来源。
成体干细胞的可塑性
成体干细胞可以突破其"发育限制性"，分化为其他类型组织细胞。 例如： − 骨髓来源的干细胞在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉及神经细胞分化； − 肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化。
成体干细胞发现与分离
• 含量非常少： − 血液中每100万个只有一个干细胞。每1×105骨髓单个核细胞中有2-5个骨髓干细胞。 • 成体干细胞具有特征细胞表面标志物（受体蛋白）。 例如：− CD133、CD34--神经干细胞 − CD71、CD90--间质干细胞 • 通过设计针对特殊受体的标记物，处理细胞，荧光检测，有荧光的说明是干细胞。
成体干细胞的优点
可从患者自身获得，不存在组织相容性的问题 不会诱发畸胎瘤的发生 不存在伦理学争执
成体干细胞的不足
• 种类：尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞。 • 数量：成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低 • 在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植。 • 增殖：成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力。 • 突变：由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等
目前研究的成体干细胞
神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、骨及软骨干细胞 心脏干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、肠胃干细胞 胰腺干细胞、肝脏干细胞、前列腺干细胞、角膜干细胞 气管干细胞、血管内皮干细胞、生殖干细胞、肿瘤干细胞
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC） • 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。 • 能自我更新、能分化成一些具有组织特化的细胞、能从骨髓中游离出来进入血液循环、能发生程序性死亡的细胞。 • 易于分离纯化，其体外扩增和诱导分化技术已较成熟 • 体外在多种细胞因子联合作用下，能够大量扩增并可以向红系、粒系、巨核系等各类细胞定向分化
（1）骨髓为造血干细胞的主要来源：人体大部分骨头的中央部门有骨腔，骨腔内所含的物质即骨髓。骨髓中有一种能起着造血功能的细胞就叫造血干细胞。
（2）造血干细胞的临床应用
•急性白血病、慢性白血病、重型再生障碍性贫血、地中海贫血、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统疾病•造血干细胞是最早发现，研究最多和最先用于治疗疾病的成体干细胞。 •造血干细胞移植是从上世纪60年代逐渐发展起来的一种医疗技术，由于最初是通过抽取供体骨髓而获得造血干细胞,所以又称为骨髓移植。 •近10年来，由于科学的进步，人们已可通过一些药物将骨髓中的造血干细胞动员到外周血中，通过血细胞分离机分取造血干细胞，称为外周血干细胞移植。
（3）骨髓移植
•骨髓移植技术使众多白细胞患者得到救治，使急性白血病患者的长期生存率提高到50%-70%。为发展此项技术做出了重要贡献的美国医学家托马斯因而获得了1990年度的诺贝尔医学奖。 •1976年托马斯报道100例晚期白血病病人经HLA相合同胞的骨髓移植后，13例奇迹般长期生存。从此全世界应用骨髓移植治疗白血病，再生障碍性贫血及其他严重血液病，严重血液功能缺陷病，急性放射病，部分恶性肿瘤等方面取得巨大成功，开创临床治疗白血病及恶性肿瘤的新纪元。
（4）三个部位生产/存储造血干细胞
•大部分在骨髓里，即骨髓造血干细胞。 •在脐带血里有丰富的造血干细胞。 •在外周血液中，也就是在血管里面有少量的造血干细胞。 骨 髓：1/400、脐带血：1/10000、外周血：1/100000
（5）造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口
① 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。 ② 造血干／祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。 ③ 造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。 ④ 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。
（6）造血干细胞移植 (hematopoietic stem cell trans-plantation, HSCT)
•给予患者进行大剂量放化疗或其他免疫抑制剂等预处理 −清除患者体内的肿瘤细胞、恶性克隆细胞或异常造血干细胞 •移植正常的异体或自体造血干细胞，从而达到治疗的目的 −重建正常的造血和免疫功能
神经干细胞： 神经干细胞是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞 。 神经干细胞可以进一步增殖、分化成中枢神经系统某些细胞类型。 当移植入中枢神经系统后不具有免疫排斥反应
（1）神经干细胞是一种具有广泛应用前景的干细胞 1）神经干细胞在脑中能根据其周围微环境的诱导而分裂，分化成为相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似。 2）中枢神经系统的血脑屏障，使淋巴细胞很难进入，因此不同个体之间，甚至是不同物种之间的神经干细胞移植，都几乎没有排斥反应。
（2）神经干细胞研究进展 神经干细胞研究起步较晚，分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。
（3）神经干细胞的研究趋势 进一步研究神经干细胞生物学特征以及分离、纯化和扩增的条件 人类神经干细胞在脑内的定位 怎样在原位诱导神经干细胞增殖分化 人类神经干细胞是否也可向其它胚层的细胞转化
骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC） 骨髓间充质干细胞，是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞，由体节发育而来。 其细胞特性稳定，在连续传代培养和冻存后仍具有多向分化潜能。 在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为间充质组织中的各类细胞，包括：骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等细胞。
胚胎干细胞与成体干细胞研究比较
胚胎干细胞
优点：无限的分化潜能 问题： （1）来源限制：人类胚胎干细胞研究存在细胞来源限制问题。 （2）体外培养困难：由于胚胎干细胞在体外培养会自发分化，而且机制还不非常清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制的技术有待完善，例如饲养层细胞与条件培养基还不成熟。 （3）安全性 − 胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，移植到体内的干细胞的分化方向会与预期不同。 − 干细胞移植后的成瘤性风险也比较大。 − 异体移植仍能引起免疫排斥反应。 （4）伦理道德问题 − 获取人的胚胎干细胞、建立胚胎干细胞系必须要破坏胚囊 − 体外培养的胚囊是否具有生命还存在着争议，所以人类胚胎干细胞研究面临伦理道德问题。
成体干细胞
优点： （1）来源方便：可以从自身获得。 （2）没有伦理学问题：成体干细胞来自成熟个体，不会损伤供体 （3）避免免疫排斥反应：同种异体胚胎干细胞及其 分化细胞用于临床会引起免疫排斥。尽管通过采取自身供体细胞核通过治疗性克隆可以得到自身胚胎干细胞，但是克隆技术的不成熟限制了目前的应用 （4）比较安全：虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但目前还不能完全控制胚胎干细胞的定向分化，容易导致畸胎瘤。相对而言，成体干细胞比较安全。 问题： （1）由于成体干细胞在组织中含量极少，又缺乏特异性检测标志，因此很难从组织中分离纯化出来。 （2）成体干细胞的可塑性机制还不清楚。例如：脂肪组织来源的干细胞不能排除随血液进入脂肪组织的造血干细胞或其他类型的干细胞。要确定一种成体干细胞的确切的组织来源还需要进行大量深入的研究。 （3）还有待建立有效的使成体干细胞在体外增殖而又能维持未分化状态的技术。 （4）成体干细胞体外长期传代后会发生表型的改变，且成体干细胞也参与肿瘤的形成。因此，有关成体干细胞的生物学安全性也越来越受到人们的关注。
诱导型多功能干细胞(iPS)
第7章 干细胞与组织工程
干细胞
定义：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
干细胞有几个主要特征 干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。 1. 干细胞本身不是终末分化细胞；能无限增殖分裂； 2. 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；
1.自我更新
(1)对称分裂（symmetric division）是指一个干细胞分裂产生的两个子细胞全是干细胞。
(2)不对称分裂（asymmetric division）是指一个干细胞分裂成一个干细胞和一个短暂增殖细胞，称之为祖细胞（progenitor cell)。祖细胞分裂形成的是两个专一功能的子细胞，不具备自我复制的能力。
2.增殖
（1）增殖的缓慢性：一般情况下，干细胞处于休眠或缓慢增殖状态。缓慢增殖还可以减少基因发生突变的可能性。
（2）增殖的自稳性：也称自我维持，是指干细胞会 自我更新维持自身数目的恒定，主要是通过不对称分裂来实现。(英国爱丁堡大学与新加坡研究人员发现，维持胚胎干细胞多功能性的关键蛋白Oct4水平下降时会诱发胚胎干细胞进行自我更新，从而使干细胞数量保持在一个均衡状态。在人类胚胎干细胞细胞膜上有一种“现在进行分裂”信号，这种信号的位置能调控细胞平面分裂开始的位置，也决定了两个子细胞中哪一个将保持干细胞特性。)
3.分化特征
（1）单能干细胞（Monopotent stem cell)：是只能分化为单一类型细胞的干细胞。
（2）多能干细胞（Multipotent stem cell）：是能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。
（3）全能干细胞（totipent stem cell）：是具有无限分化潜能的干细胞。例如胚胎干细胞。
影响分化的因素① 药物（毒性）的影响：确定环境因素如何通过影响干细胞而影响个体的生长（缺陷如何产生） ② 发育及机制与调控的研究：细胞培养—组织—细胞治疗，如糖尿病（分泌不足或受体不响应）
1998分离得到人的胚胎干细胞和胚胎生殖细胞
干细胞的分类
按分化潜能
全能干细胞（ Totipotent stem cell）： 它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞、胚胎生殖细胞。
多能干细胞（ Multipotent stem cell），具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞 。
专能干细胞（ Monopotent stem cell），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
根据来源
来源于胚胎
胚胎干细胞 ESC （来源于内细胞团）（Embryonic Stem Cell ）
胚胎性生殖细胞 EGC （来源于原始生殖细胞）（Embryonic Germ Cell ）
来源于成体
成体组织来源的干细胞 ASC（专能or单能）（Adult-derived Stem Cell ）
根据干细胞组织发生的名称
胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 视网膜干细胞：视网膜脱落，剧烈运功，无免疫性 胰腺干细胞
胚胎干细胞
定义：胚胎干细胞简称ES(Embryo stem)细胞，是一种全能干细胞,是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。
ES细胞生物学特性
1.细胞形态结构及核型
① 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。
② ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与 ICM细胞有差异。
③ 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。
④ ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。
⑤ ES细胞增殖迅速，每18—24 h分裂增殖 1次。
⑥ 此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。
维持未分化状态的胚胎干细胞生长群落特征——鸟巢状
2.细胞的高度分化潜能
ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点
1. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。
2. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”---“囊状胚体”---细胞分化物。
3. ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞 *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。
ES细胞的全能性主要体现在如下方面
①形成畸胎瘤：将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；
②形成类胚体：培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织；
③直系分化：通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；强制ES表达MyoD，ES将发育为肌肉细胞。若为主控基因，ES则发育为其控制的类型
④形成嵌合体：将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。 （knock out 必须先找到嵌合体）
胚胎干细胞的体外定向诱导分化
胚胎干细胞诱导分化的途径（目标：定向分化）
拟胚体（Embryoid body）的形成：在无饲养层系统中培养的ES细胞在体外可以形成拟胚体，拟胚体包含三个胚层来源的细胞，并能分化出三个胚层的细胞。
非拟胚体形成途径
3.碱性磷酸酶的表达
① AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。
② 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。
③ 猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。
4.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达
SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。 *早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA－1）。 *在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA-1的表达。 *小鼠SSEA-1的表达自8-细胞期开始，直到原始外胚层形成期。 *早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。
胚胎干细胞的建系
分离
从早期胚胎内细胞团（Inner cell mass, ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。ES细胞一般是指该途径分离到的胚胎干细胞。
方法
免疫学方法：表面标志物 免疫外科学方法：囊胚腔对抗体的不通透性 组织培养法：将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床 显微外科学方法：仪器与技术要求高
流程
（1）细胞团获得（引起争议之处） （2）原代培养 （3）传代培养（建系） （4）鉴定（干细胞、分化潜能）
培养
有饲养层培养法
*主要应用小鼠胚胎原代成纤维细胞（PMEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养层细胞。 *PMEF和SIM都能分泌促进胚胎干细胞增生和抑制胚胎干细胞自主分化的因子—白血病抑制因子（LIF）。 *白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF），一种天然细胞因子，因可以抑制白血病细胞系M1的生长和分化而得名。
无饲养层培养法
是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或者在基础培养基加入重组的LIF等细胞因子制备成条件培养基。保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态。 除LIF外，细胞因子还有： 碱性成纤维生长因子（Basic fibroblast growth factorb, FGF），是一种与肝素结合的多肽类丝裂原（mitogen），重要的细胞增殖与分化调节剂。 有研究发现无血清培养基中添加人的碱性成纤维生长因子（bFGF）利于保持胚胎干细胞的未分化状态。
ES细胞的鉴定
细胞的形态结构
初步鉴定指标： 形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁） 生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）
核型分析
ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验
碱性磷酸酶（AKP）染色
碱性磷酸酶（Alkaline phosphatases, AKP）活性：未分化的胚胎干细胞中含有丰富的碱性磷酸酶，活性很高；而已经分化的胚胎干细胞中碱性磷酸酶呈现弱阳性或阴性。 *常用快绿（Fast Green Staining)染色法 *对照以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照 *作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。 *结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为阳性。
干细胞标记物
*位于细胞表面可以有选择性地结合和粘附信号分子的受体蛋白。 *例如：胚胎干细胞为未分化细胞，能表达早期胚胎细胞的阶段特异性胚胎抗原（Stage-specific embryonic antigen，SSEA）。 *灵长类ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4及高分子糖蛋白TRA-1-60、TRA-1-81等。
SSEA-I 免疫荧光标记
• 第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。 • 步骤： ①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20 min； ②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min； ③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液； ④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min； ⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。 • 样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞是否出现荧光作出判断。
分化能力检测
体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成 核移植
端粒酶（Telomerase）活性
端粒酶是增加染色体末端端粒序列、维持端粒长度的一种核糖蛋白。 端粒酶有助于维持端粒长度，胚胎干细胞有着高水平的端粒酶活性，并具有长的端粒。
胚胎干细胞分化潜能评价
（1）体外分化实验：将获得的胚胎干细胞制成 悬浮液培养在铺有明胶的培养皿中，一段时间后部分细胞贴壁生长，分化成神经、肌肉、软骨等不同细胞。 （2）体内分化实验：将一定量的胚胎干细胞注射进同源动物皮下，有组织瘤生成。 （3）嵌合体形成：将胚胎干细胞通过聚集法或者注射法与受体胚胎结合，并且将胚胎移植进同期化代孕母受体，各自表达自己的基因型，最终得到嵌合体动物。
胚胎干细胞的制备
直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法，这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响分离ES细胞的效率。
卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到胚胎干细胞。
胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序： 获得功能基因 构建基因打靶载体 转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系 制备嵌合体 筛选进入生殖系小鼠 转基因小鼠（F1）表型分析 选择单系同胞交配产生（F2）代 筛选纯合子的转基因小鼠
• 目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能性，因此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。 • ES细胞的分离 早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取 • 分化抑制物的选择 饲养层（feeder lopr） 条件培养基（conditioned medium， CM） 分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA）（细胞培养物；B27） • 基础培养基的选择、添加物的选用
目前胚胎干细胞的研究
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）也可被称为多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。 • 其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。
ES细胞的应用前景： （1）揭示人及动物的发育机制及影响因素 （2）药学研究方面 （3）在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用：用人类胚胎干细胞培育出卵子 （4）在转基因动物中的应用：制备嵌合体动物
面临的难题： 增殖与分化的矛盾，体外培养ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态 潜在致癌机制，ES 细胞高度未分化 器官形成困难重重，ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破 伦理冲突
成体干细胞
定义：是存在于成体动物的许多组织和器官，具有修复和再生的能力的未成熟细胞，大多数时候处于静息状态。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。
成体干细胞来源
已经报道的含有干细胞的成体组织包括：脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏。 神经干细胞：神经系统，分化成神经元、胶质细胞。 造血干细胞：骨髓造血干细胞、脐带血造血干细胞。 间质干细胞：骨髓、脐带血、脂肪等来源。
成体干细胞的可塑性
成体干细胞可以突破其"发育限制性"，分化为其他类型组织细胞。 例如： − 骨髓来源的干细胞在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉及神经细胞分化； − 肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化。
成体干细胞发现与分离
• 含量非常少： − 血液中每100万个只有一个干细胞。每1×105骨髓单个核细胞中有2-5个骨髓干细胞。 • 成体干细胞具有特征细胞表面标志物（受体蛋白）。 例如：− CD133、CD34--神经干细胞 − CD71、CD90--间质干细胞 • 通过设计针对特殊受体的标记物，处理细胞，荧光检测，有荧光的说明是干细胞。
成体干细胞的优点
可从患者自身获得，不存在组织相容性的问题 不会诱发畸胎瘤的发生 不存在伦理学争执
成体干细胞的不足
• 种类：尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞。 • 数量：成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低 • 在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植。 • 增殖：成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力。 • 突变：由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等
目前研究的成体干细胞
神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、骨及软骨干细胞 心脏干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、肠胃干细胞 胰腺干细胞、肝脏干细胞、前列腺干细胞、角膜干细胞 气管干细胞、血管内皮干细胞、生殖干细胞、肿瘤干细胞
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC） • 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。 • 能自我更新、能分化成一些具有组织特化的细胞、能从骨髓中游离出来进入血液循环、能发生程序性死亡的细胞。 • 易于分离纯化，其体外扩增和诱导分化技术已较成熟 • 体外在多种细胞因子联合作用下，能够大量扩增并可以向红系、粒系、巨核系等各类细胞定向分化
（1）骨髓为造血干细胞的主要来源：人体大部分骨头的中央部门有骨腔，骨腔内所含的物质即骨髓。骨髓中有一种能起着造血功能的细胞就叫造血干细胞。
（2）造血干细胞的临床应用
•急性白血病、慢性白血病、重型再生障碍性贫血、地中海贫血、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统疾病•造血干细胞是最早发现，研究最多和最先用于治疗疾病的成体干细胞。 •造血干细胞移植是从上世纪60年代逐渐发展起来的一种医疗技术，由于最初是通过抽取供体骨髓而获得造血干细胞,所以又称为骨髓移植。 •近10年来，由于科学的进步，人们已可通过一些药物将骨髓中的造血干细胞动员到外周血中，通过血细胞分离机分取造血干细胞，称为外周血干细胞移植。
（3）骨髓移植
•骨髓移植技术使众多白细胞患者得到救治，使急性白血病患者的长期生存率提高到50%-70%。为发展此项技术做出了重要贡献的美国医学家托马斯因而获得了1990年度的诺贝尔医学奖。 •1976年托马斯报道100例晚期白血病病人经HLA相合同胞的骨髓移植后，13例奇迹般长期生存。从此全世界应用骨髓移植治疗白血病，再生障碍性贫血及其他严重血液病，严重血液功能缺陷病，急性放射病，部分恶性肿瘤等方面取得巨大成功，开创临床治疗白血病及恶性肿瘤的新纪元。
（4）三个部位生产/存储造血干细胞
•大部分在骨髓里，即骨髓造血干细胞。 •在脐带血里有丰富的造血干细胞。 •在外周血液中，也就是在血管里面有少量的造血干细胞。 骨 髓：1/400、脐带血：1/10000、外周血：1/100000
（5）造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口
① 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。 ② 造血干／祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。 ③ 造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。 ④ 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。
（6）造血干细胞移植 (hematopoietic stem cell trans-plantation, HSCT)
•给予患者进行大剂量放化疗或其他免疫抑制剂等预处理 −清除患者体内的肿瘤细胞、恶性克隆细胞或异常造血干细胞 •移植正常的异体或自体造血干细胞，从而达到治疗的目的 −重建正常的造血和免疫功能
神经干细胞： 神经干细胞是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞 。 神经干细胞可以进一步增殖、分化成中枢神经系统某些细胞类型。 当移植入中枢神经系统后不具有免疫排斥反应
（1）神经干细胞是一种具有广泛应用前景的干细胞 1）神经干细胞在脑中能根据其周围微环境的诱导而分裂，分化成为相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似。 2）中枢神经系统的血脑屏障，使淋巴细胞很难进入，因此不同个体之间，甚至是不同物种之间的神经干细胞移植，都几乎没有排斥反应。
（2）神经干细胞研究进展 神经干细胞研究起步较晚，分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。
（3）神经干细胞的研究趋势 进一步研究神经干细胞生物学特征以及分离、纯化和扩增的条件 人类神经干细胞在脑内的定位 怎样在原位诱导神经干细胞增殖分化 人类神经干细胞是否也可向其它胚层的细胞转化
骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC） 骨髓间充质干细胞，是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞，由体节发育而来。 其细胞特性稳定，在连续传代培养和冻存后仍具有多向分化潜能。 在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为间充质组织中的各类细胞，包括：骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等细胞。
胚胎干细胞与成体干细胞研究比较
胚胎干细胞
优点：无限的分化潜能 问题： （1）来源限制：人类胚胎干细胞研究存在细胞来源限制问题。 （2）体外培养困难：由于胚胎干细胞在体外培养会自发分化，而且机制还不非常清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制的技术有待完善，例如饲养层细胞与条件培养基还不成熟。 （3）安全性 − 胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，移植到体内的干细胞的分化方向会与预期不同。 − 干细胞移植后的成瘤性风险也比较大。 − 异体移植仍能引起免疫排斥反应。 （4）伦理道德问题 − 获取人的胚胎干细胞、建立胚胎干细胞系必须要破坏胚囊 − 体外培养的胚囊是否具有生命还存在着争议，所以人类胚胎干细胞研究面临伦理道德问题。
成体干细胞
优点： （1）来源方便：可以从自身获得。 （2）没有伦理学问题：成体干细胞来自成熟个体，不会损伤供体 （3）避免免疫排斥反应：同种异体胚胎干细胞及其 分化细胞用于临床会引起免疫排斥。尽管通过采取自身供体细胞核通过治疗性克隆可以得到自身胚胎干细胞，但是克隆技术的不成熟限制了目前的应用 （4）比较安全：虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但目前还不能完全控制胚胎干细胞的定向分化，容易导致畸胎瘤。相对而言，成体干细胞比较安全。 问题： （1）由于成体干细胞在组织中含量极少，又缺乏特异性检测标志，因此很难从组织中分离纯化出来。 （2）成体干细胞的可塑性机制还不清楚。例如：脂肪组织来源的干细胞不能排除随血液进入脂肪组织的造血干细胞或其他类型的干细胞。要确定一种成体干细胞的确切的组织来源还需要进行大量深入的研究。 （3）还有待建立有效的使成体干细胞在体外增殖而又能维持未分化状态的技术。 （4）成体干细胞体外长期传代后会发生表型的改变，且成体干细胞也参与肿瘤的形成。因此，有关成体干细胞的生物学安全性也越来越受到人们的关注。
诱导型多功能干细胞(iPS)
组织工程
组织工程技术
组织工程(Tissue Engineering) ：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。20世纪80年代提出概念。
关键：通过模拟体内的组织微环境条件，使细胞得以正常生长和分化。 核心问题：如何建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。
细胞外基质(extracellular matrixc,ECM) （1）定义：动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。 （2）分布：结缔组织中ECM含量较高。 （3）组成：构成细胞外基质的大分子包括：胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖四大类。 （4）功能： 1）ECMs提供细胞所需的力学和化学信息，是细胞发挥功能的环境；对细胞群体有支持、保护的作用。 2）ECMs对细胞形态、迁移、增殖、分化有调节作用。
组织工程三要素（种子细胞、支架材料、生长因子）
种子细胞
1.定义：种子细胞(Seed cell)：是组织修复或再生的细胞材料。 2.来源（1）功能细胞：组织来源体细胞。 （2）干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞。 3.特点：容易获得和体外培养、遗传稳定。 4.问题（1）同种、异种细胞存在免疫排斥等问题。 （2）干细胞潜在的理想种子细胞，诱导分化技术有待完善。 （3）多种类型细胞协调增殖、分化。
支架材料
定义：组织工程支架材料是指替代细胞外基质使用的生物医学材料。
特点： （1）生物相容性：生物医学材料引起宿主反应和产生有效作用的能力。 （2）生物降解性：材料完成支架的作用后能被降解,降解速率与细胞生长速率相互协调。 （3）合适的三维立体结构。 （4）加工性与一定的机械强度。 （5）良好的消毒性能。
分类： 有机材料与无机材料、 天然材料和人工合成材料、 单一材料和复合材料。
（1）有机材料 1）天然高分子材料 A、胶原、 B、壳聚糖、 C、透明质酸等 2）合成高分子材料 聚乳酸（Polylacticacid，PLA） 聚羟基乙酸 （Polyglycolicacid,PGA） 聚羟基丁（Polyhydroxybutyrate,PHB）等。
A、蛋白类 胶原（Collagen） *胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白, 是构成细胞外基质的骨架，是胞外基质重要的结构蛋白。 *根据组成的氨基酸与聚合度不同有10种。具有高度缠绕的螺旋结构的纤丝，由纤丝与其他基质分子相互作用达到组织需要的强度、弹性。 *成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞等合成或分泌，分布于各个部位。
B、多糖类 壳聚糖（Chitosan） *甲壳质的基本单位是乙酰葡萄糖胺，它是由1000～3000个乙酰葡萄糖胺残基通过p1，4糖甙链相互连接而成聚合物，是节肢动物角质内的主要结构多糖。 *壳聚糖是甲壳质的部分脱乙酰化产物，具有阳离子性质，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等带负电荷的大分子聚集在支架内，即利于收集组织液中的生长因子。 透明质酸 （Hyaluronic acid, HA） *透明质酸由N-已酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。 *在结缔组织中比较丰富。透明质酸可高度水化，对组织的水分平衡和关节的润滑有重要作用，已经在整形外科中被广泛采用。 *保护及润滑细胞，在化妆品、美容行业广泛使用。
（2）无机材料 *氧化铝陶瓷、碳纤维、生物陶瓷、羟基磷灰石、合金等，主要用于人工骨、人工肌腱、人工关节等。 *例如：钴、钛、钢铁基合金金属材料组成人工髋关节的股骨头、膝关节的股骨髁的表面，超高分子聚乙烯材料组成人工髋关节的髋臼股份、人工膝关节的胫骨平台部分，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于人工关节假体与骨组织的固定。
（3）复合材料 复合材料：由两种或两种以上不同物理化学性质的材料复合而成的新材料，一般由基体材料和增强材料组成。 包括无机材料、有机材料、天然材料与合成材料间的组合 例如：羟基磷灰石-甲壳素、羟基磷灰石-PLA、聚乳酸（Polylactic acid,PLA）-聚羟基乙酸（Polyglycolicacid,PGA）：PLGA等。
生长因子 细胞对外部环境产生的应答是通过感知某种化学信号或物理刺激，并将之传递到细胞核中，促发或者抑制基因的表达实现的。细胞的增殖与分化由各种因子调节。
物理因子 主要是应力的作用： 流体切应力（Flow shear stress）：由血流对血管壁施加的力。体外可采用常流和脉动流循环装置调节切应力大小。 张应力（Tensile stress）：体内有心脏搏动，肌肉收缩等张应力。可采用弹性泡沫或纺织网等载体材料模拟体内的张应力。
细胞生长因子 *细胞生长因子（Cell growth factor）主要是指在细胞间传递信息、对细胞生长具有调节功能的一些多肽。 *转移生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）： 一种分泌型的多功能蛋白，可以调节细胞增殖、分化与细胞外基质分泌，参与炎症和组织的修复。 *骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP) ：1965年于脱矿化骨的骨基质中发现的，因其能诱导骨、软骨形成而得名。 *成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）：是不含糖的分子量为16KD的单链多肽，因能促进成纤维细胞生长而得名。由于对血管也有较强的促进作用，又称为血管生长因子。可以诱导血管化、骨形成并促进神经再生。 *表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF）是由53个氨基酸组成的单链多肽。是表皮细胞和间充质细胞的一种有效的促分裂剂。能促进伤口愈合，在体外可以刺激角化细胞分裂，在体内促进上皮的再生。 *神经生长因子 (Nerve growth factor, NGF)为神经细胞特异性分泌的营养蛋白，是具有营养、保护神经元及促进突起生长等生物学功能的神经细胞调节因子。对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、修复、再生和功能特性均有重要的调控作用。 *肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF）因最初被发现可剌激肝细胞合成DNA而得名，是由728个氨基酸残基组成的多肽单链。肝细胞生长因子是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动，能促进肾小管形态发生，在肾脏的发育、再生中具有较强的作用。
生长因子研究与制备—骨形态发生蛋白（BMPs） *1965年美国首先从骨基质中分离出骨形态发生蛋白，经过25年才得以纯化。随后克隆了相关基因。 *原位状态下以ng/g骨基质剂量释放足以促发骨修复，人工基质需要mg/g剂量才能促发骨修复，因此成本非常高。 *利用转基因技术将BMP基因转染到骨髓细胞中，再将其种植在矿化基质上，达到骨修复的目的。
技术路线与方法 A、细胞接种 浸渍法：将经预湿处理材料置于细胞悬浮液中实现细胞接种。 沉淀法：将细胞液缓慢逐滴滴加到已经预湿的支架材料上，放置培养箱中2-4小时，待细胞充分粘附后缓慢加入培养液培养。 凝胶法：将高密度细胞悬浮液与多种物质如胶原、藻酸纳、几丁质等按照一定工艺复合形成凝胶，细胞均匀地分布于凝胶内。 吸附法：将已预湿的支架材料置于培养皿中细胞悬液中或用滴管将细胞液滴加在材料上，然后利用负压使细胞吸附在材料上。 技术路线与方法 B、细胞因子的控制释放 1.在支架材料构建时使细胞因子结合在支架材料内部，并能缓慢释放。 2.包埋或者微囊化是目前控制细胞生长因子释放的一个重要方法
组织工程生物反应器
1.微重力旋转式生物反应器 （1）转壁式生物反应器：一般由两个内外同心圆柱组成。内柱由半透膜构成，气体可通过膜交换。内外柱之间充以连续灌注的培养介质。将细胞与培养液置入内、外圆柱体。整个装置可以绕内轴旋转，离心力与重力平衡，为细胞生长提供一个微重力环境。 普通培养条件下只能呈二维贴壁生长的哺乳动物细胞表现出三维增殖与分化形成有功能的组织块。
（2）流体应力生物反应器 模拟人体血管应力环境而设计的用于体外构建组织工程化血管的装置。 主要由可以通过循环液体的硅胶管、压力传感器、蠕动泵、储液罐、电磁阀等组成。可通过形成有波动的液流并能控制流量来模拟体内血管的应力环境。
最新的前沿技术——3D打印技术
“墨水”可以是各种材料，比如金属、陶瓷、塑料、细胞、砂石甚至各种食物。通过高温或者激光的方法，“墨水”被抽成丝状。 半流体状态的材料按照计算机中的三维模型，喷嘴按照x、y、z三个坐标轴的定位点喷出，然后在指定的位置凝固成形。经过一层一层地堆积后，模型就渐渐形成立体的结构。
*3D 打印拯救患有气管支气管软化的婴儿； *美国一家医院使用3D打印出人的头骨，来替代患者原本高达 75%已受损骨骼。 *美国康奈尔大学Lawrence J.Bonasser 博士领导的研究小组利用 3D 打印技术修复人体退化的脊椎间盘。 *利用3D打印技术制造出患者特殊心脏模型
以骨为例 1.细胞 成骨细胞：合成ECMs、矿物质、胶原，组装成新骨 破骨细胞：分泌酶使ECMs、矿物质、胶原被吸收 软骨细胞：合成ECMs构成软骨干细胞 2.支架：羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH，HA]、胶原纤维 3.生长因子：骨形态发生蛋白（BMP）
组织工程应用
1.组织工程牙齿
细胞：牙齿上皮细胞、间叶细胞 支架：胶原蛋白凝胶 培养基：D-MEM（Sigma），10%FCS
2.组织工程耳
*先以3D摄影机围绕患者头部拍摄耳朵照片，然后把几何构造图输入电脑，用3D打印机输出，制成耳朵软模型。 *接着再把充满牛耳软骨细胞的特殊胶原蛋白胶注入软骨，形成软骨骨架。 *几周内软骨就会逐渐成长，取代覆盖其外的胶原蛋白，3个月后，柔软且具有功能的外耳就此长成。
3.组织工程皮肤
构建步骤 （1）种子细胞与培养液 成纤维细胞：DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素等。 表皮角质形成细胞：DMEM+Ham F-12培养基、表皮生长因子等。 （2）支架材料：聚羟基乙酸（PGA）。 （3）构建成纤维细胞-PGA复合物： 酶法消化收集真皮成纤维细胞，接种在PGA上，加入培养液培养。 （4）接种表皮角质形成细胞在前面的复合物上，更换表皮角质形成细胞培养基培养5天左右。 （5）双层皮肤成熟： 将复合物放在可渗透膜上，进行气-液界面培养，促进表皮角质形成细胞的进一步分化。再培养1周，形成含真皮和表皮两层结构的组织工程化皮肤。
4.组织工程肾脏
细胞：新生大鼠肾脏细胞、人脐带静脉上皮细胞 支架材料：去除了细胞的肾脏，包含皮层、脉管、髓质、尿管等。 培养基：REGM、EGM2（Lonza）
组织工程问题与挑战
1.干细胞诱导分化技术
2.种子细胞分离与培养
3.接种支架材料的方法
4.支架材料的设计与优化
5.细胞因子的释放与支架材料相结合的设计，种子细胞表达
6.血管化
7.复杂性：多细胞协同培养、分化控制
8.体外组织器官再生机理有待揭示