实验方法

将标准品和样品加入到提供的平板中与50μl皮质酮AChE示踪剂和50μl皮质酮EIA抗血清在室温摇晃下孵育2小时

实验方法

• 使用八臂径向迷宫
  • 
  • 进行训练
  • 用水为诱饵
  • 进行空间学习能力测试
  • 在水限制下过夜
  • 进行测试
• 血浆和组织的收集
  • 皮下注射硫喷妥钠
    • 心脏中提取血液，在EDTA管采集后离心
      • 用PBS进行心脏灌注后用PFA灌注
        • 取出大脑，分为两个半球
          • 左半球进行免疫组化评估
          • 右半球进行MRI成像
• 皮质酮ELISA
  • 测定血浆皮质酮水平
    • 第一步，将标准品和样品加入到提供的平板中与50μl皮质酮AChE示踪剂和50μl皮质酮EIA抗血清在室温摇晃下孵育2小时
    • 第二步，用350μl的洗涤缓冲液洗涤平板5次。为了进行开发，在每个孔中加入200μl的Ellman试剂，在黑暗的摇晃中孵育90min
    • 第三步，用ELISA平板阅读器(Zenyth3100)在405nm处测量信号吸光度
• 统计分析
  • 数据来源
    • 所有数据均报告为平均±SEM
    • 平均值之间的差异采用学生t检验、单因素方差分析
    • Fisher最不显著差异事后检验，或双向方差分析
    • Bonferroni事后检验，以时间和基因型作为MRI分析的两个因素
  • 结果分析
    • WT小鼠(A)的侧脑室大小正常，而3xTg-AD小鼠在14月龄时(B)的海马水平上增大
    • 在APPSwDI小鼠中，12月龄(C).时心室大小没有明显变化不幸的是，在3xTg-AD小鼠(B)中，地柏林油漏入扩大的心室，使其变黑，否则心室在T2*序列中呈白色
• 微观评价
  • 为了定量，对每只动物的2到4个脑切片进行皮质染色模式评估
  • 采用ImageJ光密度(O.D.)评价IV型胶原蛋白染色
• 核磁共振分析
  • 7、14和20月龄和喂食正常或胆固醇饮食的WT和3xTg-AD小鼠的大脑
  • 6月龄和12月龄APPSwDI小鼠的大脑进行扫描
• 免疫组化
  • 自由漂浮的条件下进行
    • 第一步，右半脑冷冻后切片
    • 第二步，洗涤后抚育
    • 第三步，猝灭内源性过氧化物酶
    • 第四步，洗涤后进行处理
  • 评估血脑屏障渗透性
• 血浆胆固醇水平
  • 分析血浆胆固醇水平
    • 第一步，将60μl血浆与1ml酒精氢氧化钾混合，在75°C下孵育30min
    • 第二步，冷却至室温后，向样品中加入1ml去离子水和2ml正己烷
    • 第三步，搅拌15min，200×g离心5min
    • 第四步，将一层正己烷（上）转移到玻璃管中，在75°C下蒸发
    • 第五步，将残基溶解在150μl流动相(44%乙腈，54%异丙醇，2%dH2O)中，以100μl注入柱(核素120-5C18,250×4.6mm)，流量为0.6ml/min
    • 第六步，使用UV检测器（岛津）在205nm处观察胆固醇