细胞生物学之蛋白质分选与膜泡运输

来自丁明孝《细胞生物学》第五版个人整理知识点：蛋白质分选与膜泡运输（细胞内蛋白质的分选、细胞内膜泡运输）。

【细胞生物学】06 蛋白质分选与膜泡运输

• * N端在内质网腔，C端在胞浆 * N端含被切割的信号肽序列 * 插膜序列为STA序列 * Type II * C端在内质网腔，N端在胞浆 * 含不可切割的内质网信号序列（SA序列） * Type III * N端在内质网腔，C端在胞浆 * 含不可切割的内质网信号序列（SA序列） * 与Type I的区别 * 插膜序列为SA序列 * 无信号肽，只有不可被切割的SA序列 * Type IV * 含多个跨膜片段 * 组合使用STA和SA序列确定插膜 * 确定插膜顺序的因素 * 由插膜螺旋上游（N端侧）或下游（C端侧）的带电荷AA的富集度决定 * 带正电荷的倾向于cytosol一侧 * 单次跨膜 * 1 * 其N端具有线粒体基质靶向序列 * 2 * 前体蛋白与内外膜接触点附近的输入受体（Tom20/22）结合 * 3 * 引进输入孔 * 4-5 * 输入的蛋白质进而通过内外膜接触点的输入通道（外膜为Tom40，内膜为Tim23/17） * 线粒体基质分子伴侣Hsp70与输入的蛋白质结合并水解ATP以驱动基质蛋白的输入 * 6 * 输入蛋白的基质靶向序列在基质蛋白酶作用下被切除，同时Hsp70也从新输入的基质蛋白上释放下来 * 7 * 折叠成活性形式 * 尚未折叠的两种蛋白前体手提箱你通过外膜上相同的转运基质蛋白的通道进入基质 * N端基质靶向序列被基质蛋白酶切除，从而使类囊体靶向序列暴露 * 进入基质后两种转运蛋白的转运途径产生分歧 * 质体蓝素 * SRP依赖途径 * 2 * 在基质空间保持非折叠状态 * 需要一组分子伴侣参与 * 在类囊体靶向序列指导下与叶绿体SRP（和细菌SRP密切相关）结合，然后再类囊体膜上叶绿体SRP受体再转运蛋白SecY的介导下，转运到类囊体腔 * 3 * 进入腔内后，质体蓝素的类囊体靶向序列被内切蛋白酶切除，蛋白质折叠产生成熟构象 * 金属结合蛋白 * pH依赖的途径 * 2 * 非折叠的金属结合蛋白再基质中折叠并与其辅因子结合 * 3 * 在类囊体靶向序列N端的两个Arg残基和跨叶绿体内膜的pH梯度是折叠蛋白输入到类囊体腔所必须的 * 4 * 类囊体膜上的转运蛋白至少由4种与细菌质膜相关的蛋白质组成，输入到类囊体腔的金属结合蛋白其N端的类囊体靶向序列被切除，产生成熟的构象
• 蛋白质分选与膜泡运输
  • 细胞内蛋白质的分选
    • 核糖体基础知识
      • 基本类型
        • 根据分布
          • 附着核糖体
          • 游离核糖体
          • 完全相同
        • 根据沉降系数
          • 70S核糖体
            • 原核生物
          • 80S核糖体
            • 真核生物
      • 主要成分
        • r蛋白质
          • 40%
          • 核糖体表面
        • rRNA
          • 60%
          • 核糖体内部
      • 结构单元
        • 原核生物
          • 30S+50S
        • 真核生物
          • 40S+60S
        • 线粒体
          • 28S+39S
          • 部分蛋白质由核基因编码
      • 动态组装
        • 核糖体的大小亚基通常游离在包浆中，只有小亚基与mRNA结合后，大亚基才与小亚基结合，形成完整核糖体
      • rRNA
        • 具有肽酰转移酶的活性
          • 合成肽键
        • 为tRNA提供结合位点
          • A位点
            • 进入位点
          • P位点
            • 形成肽键
          • E位点
            • 脱离位点
        • 为多种蛋白质结合因子提供合成位点
        • 在蛋白质合成起始时参与同mRNA的选择性结合，以及在肽键的延伸中与mRNA结合
        • 与核糖体大小亚单位的结合、校正阅读、五一一脸或框架漂移的校正、抗菌素的作用等有关
      • rProtein
        • 对rRNA折叠成有功能的三维结构十分重要
        • 在蛋白质合成中，某些r蛋白可能对核糖体的构象起“微调”作用
        • 在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中，r蛋白与rRNA共同行使功能
      • 核糖体在mRNA上的滑动
        • #####
          • EF-G（延长因子G）
            • 帮助核糖体在mRNA上滑动一个密码子
            • 需要GTP使其活化，随后其GTP水解为GDP
          • EF-Tu（延长因子Tu）
            • 帮助aa-tRNA插入A位点
            • 需要GTP使其活化，随后其GTP水解为GDP
          • LepA
            • 帮助核糖体在翻译异常暂停时“回退”
          • 当完全无法继续翻译时，会启动生物大分子的自毁
            • 核糖体解聚，新生肽链降解
          • 去除后只会部分降低蛋白质合成的速率
      • polysome（多聚核糖体）
        • 多个核糖体串连在mRNA上
    • 信号假说与蛋白质分选信号
      • 蛋白质靶向转运/蛋白质分选
        • 蛋白质合成以后转运到达特定部位，参与组装细胞结构，发挥其生物学功能
      • 信号假说
        • 分泌蛋白可能在N端携带有短的信号序列
        • 一旦该序列从核糖体翻译合成，结合因子便与该序列结合，指导其转移到内质网膜，后续翻译过程将在内质网膜上进行
      • 指导分泌蛋白在rER上合成的决定因素
        • 蛋白质N端的信号肽（signal sequence/ signal peptide）
          • 一般由16-26个AA组成
          • 结构
            • 疏水核心区
            • 信号肽的C端
            • 信号肽的N端
          • 和蛋白质本体间有信号酶的作用位点
        • 信号识别颗粒（SRP）
          • 一种核糖核蛋白复合体
            • 6种不同的蛋白质
            • 一条长度约300个核苷酸的7S RNA
          • 通常存在于细胞质基质中
            • 等待信号肽从多聚核糖体上延伸暴露出来，SRP既可与新生肽信号序列和核糖体大亚基结合，又可与内质网膜上SRP受体结合
          • 结构
            • 两个结构域
              • * 信号肽识别结构域 * 具有GTP酶活性 * 核糖体结合结构域 * 与信号肽结合后，能阻断新生肽链的翻译
        • 内质网膜上信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，DP）
          • 内质网膜上的整合蛋白
          • 结构
            • α亚基
            • β亚基
          • 可特异地与SRP结合
            • 当SRP的p54亚基和SRP受体的α亚基与GTP结合时，会增进SRP/新生肽/核糖体复合物与SRP受体结合的强度
      • 共翻译转运
        • 定义
          • 分泌蛋白及整合膜蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程
        • 在无细胞系统中蛋白质的翻译过程与SRP、DP和微粒体的关系
        • 过程
          • 游离的核糖体大小亚基感知到mRNA链后，在mRNA链上进行组装，对其进行扫描，直到AUG，开始合成
            • * 成熟的mRNA 5'有帽，3'有polyA
          • 1-2
            • * 分泌蛋白合成起始，内质网靶向信号序列合成，延伸至约80个AA时，信号序列暴露，并被游离的SRP识别 * 肽链延伸步骤暂时停止 * 防止新生肽N端损伤和成熟前折叠
          • 3
            • * SRP与内质网膜上的受体结合，引导核糖体-新生肽复合物附着到内质网膜上 * 1*GTP与SRP-p54亚基结合，1*GTP与DP-α亚基结合，使二者的相互作用被强化
          • 4
            • * 核糖体/新生肽与内质网膜的移位子（translocon）结合，伴随GTP水解，SRP与相应受体解离，返回细胞质基质中重复使用，肽链又开始延伸，通过移位子以袢环的形式进入内质网腔
          • 5
            • * 新生肽链的信号序列被信号肽酶切除，并被降解
          • 6
            • * 新生肽链继续延伸，直至多肽链的合成结束
          • 7-8
            • * 蛋白质进入腔内并折叠，核糖体释放，移位子关闭
        • 内质网膜整合蛋白
          • 均依赖α螺旋跨膜
            • 一般由20-25个疏水氨基酸残基形成
            • β-sheet跨膜蛋白不是通过共翻译转运途径转运
          • 拓扑学类型
            • Type I
          • SA
            • 内在信号锚定序列
          • STA
            • 内在停止转移锚定序列
          • 合成过程
            • Type I
              • * * 正常翻译，肽链在内质网内不断延伸 * 直到碰到STA序列，肽链不再进入内质网腔，STA转移到内质网膜上 * 剩余新翻译的肽链留在cytosol（胞质侧）
            • Type II & Type III
              • * * SA序列可以正向插膜，也可以反向插膜 * 连续3个带正电ASA决定这一侧出现在cytosol * type II带正电AA位于SA的N端 * type III带正电AA位于SA的C端
            • Type IV
              • *
            • GPI锚定蛋白
              • * * GPI蛋白 * 以Type I方式合成，在GPI转移酶作用下，对膜蛋白进行GPI修饰，通过PI插入脂双层 * Type I产生的STA α-helix在成熟蛋白中被切掉
      • 蛋白质分选信号序列
        • 连续的氨基酸序列
          • 信号肽
          • 导肽
            • 指导在细胞质基质中合成的蛋白质进入线粒体、叶绿体及过氧化物酶体的信号序列
            • 翻译后转运
              • * 蛋白质在细胞质基质中合成以后再转移到这些细胞器中 * 需要消耗ATP使多肽去折叠，需要分子伴侣蛋白的协助
        • 三维结构的信号斑
          • 在蛋白折叠完成后，其表面原子按一定的空间结构排布形成
          • 形成信号斑的AA可能在线性氨基酸序列上相距很远
          • 在成熟蛋白质中不被切除
    • 蛋白质分选转运的基本途径与类型
      • 蛋白质分选的途径（核基因编码）
        • 翻译后转运途径
          • 在细胞质基质游离核糖体上完成多肽链的合成，然后转运至膜围绕的细胞器，或称为细胞质基质中的可溶性驻留蛋白和骨架蛋白
        • 共翻译转运途径
          • 蛋白质合成在游离核糖体上起始后，由信号肽及其与之结合的SRP引导转移至rER，然后新生肽边合成边转入rER腔或定位在ER膜上，经转运膜泡运至高尔基体加工包装，再分选至溶酶体、细胞质膜或分泌到细胞外
          • 内质网和高尔基体本身的蛋白分选也通过这一途径完成
      • 蛋白质转运的类型（根据蛋白质分选的转运方式或机制的不同）
        • 蛋白质的跨膜转运
          • 共翻译转运途径中的跨膜
          • 翻译后转运途径中的跨膜
        • 膜泡运输
          • 涉及供体膜出芽形成不同的转运膜泡、依赖细胞骨架和分子马达的膜泡运输以及膜泡与靶膜的融合等过程
        • 选择性的门控转运
          • 蛋白质通过核孔复合体
        • 细胞质基质中的蛋白质转运
          • 与细胞骨架系统密切相关
    • 蛋白质向线粒体和叶绿体的分选
      • 蛋白质从细胞质基质到线粒体的转运
        • 线粒体蛋白
          • 99%的线粒体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中翻译为蛋白质前体，再通过线粒体转位酶运输至线粒体的各个部位
          • 超过90%的蛋白前体经线粒体外膜TOM转位酶复合体运输进入线粒体
        • 蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质
          • TOM
            • 7个亚基组成的膜蛋白复合体
            • 核心通道
              • * Tom40 * β桶蛋白
            • 调控蛋白
              • * Tom5、6、7
            • 受体蛋白
              • * Tom20、22、70
            • TOM的组装是一个瞬时、多步骤且高度动态的过程
              • * 需要线粒体外膜SAM复合物的协助 * TOM复合物能帮助自身的折叠
            • 单次α螺旋跨膜
          • TIM
            • 跨越内膜的膜蛋白复合体
          • N端靶向信号序列
            • 由20-50个AA组成
            • 富含疏水氨基酸，带正电荷的碱性氨基酸，羟基氨基酸
            • 缺少带负电荷的氨基酸
            • 可被TOM复合物上的受体识别
            • 有利于基质蛋白的靶向信号序列形成两亲的α螺旋
          • 基本步骤
            • 在游离核糖体上合成前体蛋白，与分子伴侣Hsp70结合，使其保持未折叠或部分折叠状态
        • 线粒体内膜蛋白的输入
          • 途径A和途径B
            • * 共同点 * N端都有基质靶向序列 * 在线粒体外膜上都利用Tom40为输入孔道 * 外膜上Tom22/20作为识别N端基质靶向序列的输入受体 * 内膜转运蛋白都是Tim23/17 * 基质Hsp70与输入基质可溶性蛋白起相同作用 * 不同点 * 通过B途径输入的内膜蛋白不但具有N端基质靶向序列，还有内在的疏水结构域 * 前者引导前体蛋白进入线粒体基质 * 后者可被内膜蛋白Oxa1识别 * Oxa1是一种与内膜蛋白插入相关的蛋白质，由线粒体基因组编码，在线粒体基质核糖体上合成 * B途径输入的内膜蛋白先进入基质，基质靶向序列被切割后再装配到内膜上
          • 途径C
            • * 输入的内膜蛋白是多次跨膜蛋白 * 缺少N端基质靶向序列 * 含有被Tom70/22输入受体识别的多个内在靶向序列 * 内膜转运通道为Tim22/54 * 两种膜间空间蛋白Tim9/10被认为起分子伴侣的作用
          • 一定需要分子伴侣的参与
        • 线粒体膜间隙蛋白的输入
          • 途径A
            • * 主要途径 * 过程与内膜蛋白途径A类似 * 蛋白质内在靶向序列定位在膜间隙，并且在转运过程中被内膜上蛋白酶于膜间隙一侧切割，释放的蛋白质折叠并与血红素结合
          • 途径B
            • * 通过外膜Tom40输入孔，直接进入膜间隙
      • 蛋白质从细胞质基质向叶绿体的分选：基质与类囊体蛋白的靶向输入
        • 转运机制
          • 以质体蓝素蛋白前体和金属结合蛋白前体为例
      • 蛋白质从细胞质基质向过氧化物酶体的转运
        • 过氧化物酶体
          • 异质性细胞器
          • 功能
            • 解毒功能
              • * 机体中一些有毒成分能通过过氧化物酶体进行代谢 * 常含 * 依赖于黄素（FAD）的氧化酶 * 过氧化氢酶（40%）
            • 分解脂肪酸等高分子，向细胞直接提供热能
              • * 线粒体 * 中等长度脂肪酸（10-20碳） * 过氧化物酶体 * 中等长度脂肪酸 * 超长链脂肪酸（>20碳）
            • 在绿色植物叶肉细胞中
              • * 光呼吸反应 * 催化CO2固定反应副产物的氧化
            • 在种子萌发过程中
              • * 降解储存的脂肪酸并最终生成葡萄糖
          • 产生
            • 由已有的过氧化物酶体分裂产生
            • 从头合成产生
              • * 空的膜泡 * 膜脂可能在内置网上合成后再转运而来 * 先装配膜上的蛋白，再装配基质中的蛋白 * 均有客机因编码，主要在细胞质基质合成 * 最后分裂
        • 蛋白质向过氧化物酶体的转运
          • 蛋白质往往含有C端信号识别序列PTS1
            • * 若为PTS2则位于N端
          • PTS1/2指导蛋白质的转运都已折叠好的方式进行
          • 跨膜过程依赖ATP水解
  • 细胞内膜泡运输
    • 膜泡运输概述
      • 膜泡运输
        • 定义
          • 指从细胞内膜系统的某个细胞器表面出芽形成的囊泡，或者谁由细胞膜内陷形成的内吞泡在分子马达的介导下沿微管或微丝转运到目的地，并与靶细胞器或细胞膜融合的过程
        • 是蛋白质分选、运输的一种特有的方式，普遍存在于真核细胞中
        • 在转运过程中不仅涉及蛋白质本身的修饰、加工和组装，还涉及到多种不同膜泡定向运输及其复杂的调控过程
      • 转运膜泡由各种蛋白质包被
        • 使膜泡具有各种分选信号
        • 包装特异性取决于被转运蛋白的靶向分选序列
    • COP II包被膜泡的装配及运输
      • COP II介导细胞内顺向运输（ER→高尔基体）过程
      • COP II
        • 结构
          • 小G蛋白Sar1
            • 调控包被装配的过程
            • 激活包被蛋白
            • 通过GTP-GDP结合的转换，起分子开关的作用
          • Sec23/Sec24复合物
          • Sec13/Sec31复合物
          • 大的纤维蛋白Sec16
        • 平时溶解在细胞质中，需要时装配至特定膜泡
      • • 装配过程
          • 1
            • 细胞质中可溶性Sar1-GDP与ER膜蛋白Sec12（鸟苷酸交换因子）相互作用，催化形成Sar1-GTP
            • GTP的结合引发Sar1构象改变暴露出疏水N端并插入ER膜
            • 膜结合的Sar1对包被蛋白的进一步装配起募集者作用
          • 2
            • Sar1与膜的结合提供了随后Sec23/Sec24复合物的结合位点，从而在ER膜出芽区形成三重复合物Sar1-GTP/Sec23/Sec24
          • 随后，Sec13/Sec31复合物与三重复合物结合
            • 发挥COP II包被骨架的作用
          • 最后，大的纤维蛋白Sec16结合在ER膜的胞质表面
            • 与已装配的复合物相互作用
            • 组织其他包被蛋白的结合，从而提高包被蛋白的聚合效率
          • 3
            • 包被组装完成后，Sec23亚基促进GTP被Sar1水解
          • 4
            • Sar1-GDP从膜泡上释放，引发包被去装配而解聚
    • COP I包被膜泡的装配与运输
      • COP I介导细胞内膜泡逆向运输（高尔基体→ER）
        • 包括再循环的脂双层、内质网主流的可溶性蛋白和膜蛋白
        • 是内质网回收错误分选的逃逸蛋白的重要途径
      • COP I
        • 结构
          • GTP结合蛋白ARF
            • 和Sar1相似
            • 调节膜泡转运
            • 也参与网格蛋白包被膜泡的装配调节
          • 7种不同的蛋白质亚基
      • 决定特异蛋白去向的因素
        • 转运膜泡将驻留蛋白有效排斥在外
        • 对逃逸蛋白的回收机制
          • 通过回收信号介导的特异性受体完成
            • 识别内质网驻留蛋白C端的回收信号序列
              • * 如KDEL或KKXX序列
          • 有利于防止内质网腔蛋白的损失
    • 网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的装配与运输
      • 介导分泌泡和内吞泡的形成
      • 相关蛋白
        • 网格蛋白
          • 组成外层蛋白
          • 呈三腿结构
        • 接头蛋白
          • 组成内层蛋白
          • 将网格蛋白包被连接到质膜上
          • 能特异性地促使一些膜结合蛋白富集到形成包被的膜区
          • 在胞质面与转运的膜蛋白或膜受体（结合腔内可溶性蛋白）特异性结合
            • 决定那些蛋白将被包装转运或那些蛋白将被排除在外
            • 由转运蛋白的分选信号决定
        • ARF
      • 膜泡形成步骤
        • • 供体膜的出芽和包被的装配
          • 芽体缢缩
            • 发动蛋白（dynamin）
              • * 发动蛋白围绕颈部聚合，催化GTP水解，释放的能量驱动发动蛋白构象改变，导致网格蛋白/接头蛋白包被膜泡从供体膜断裂并释放
          • 形成不久后便脱去包被
            • ARF开关从结合GTP状态转变为结合GDP状态
            • ATP水解提供能量
            • 使v-SNARE得以暴露，利于膜泡与靶膜的融合
    • 转运膜泡与靶膜的锚定和融合
      • 膜泡运输的关键步骤
        • 供体膜的出芽、装配和断裂，形成不同的包被转运膜泡
        • 在细胞内由马达蛋白驱动、以微管为轨道的膜泡运输
        • 转运膜泡与特定靶膜的锚定和融合
      • Rab蛋白
        • 一类小G蛋白
        • 不同囊泡选择不同Rab作为标签
        • 参与膜泡靶向转运
          • 在特异性GEF催化下活化，构象改变
          • 与特定膜泡的表面蛋白相互作用，通过类戊二烯基团插入转运膜泡内
          • 与靶膜上称作Rab效应器的结合蛋白相互作用，从而使转运膜泡被锚定在适当的靶膜上
          • 膜泡融合后Rab蛋白的GTP水解，引发Rab-GDP的释放
          • 在细胞质中会与GDI（GDP解离抑制物）结合
      • v-SNARE和t-SNARE蛋白
        • 介导转运膜泡与靶膜融合
          • v-SNARE
            • 位于囊泡膜上
            • 常见为VAMP（一根α螺旋）
          • t-SNARE
            • 位于靶膜上
            • 常见为SNAP-25（两根α螺旋）和syntaxin（一根α螺旋）
          • 形成四螺旋束
            • v-SNARE和t-SNARE的结合具有特异性
            • 由NSF和α-SNAP介导螺旋束的解螺旋
              • * NSF消耗ATP