生物化学、蛋白质的分离与鉴定

生物化学 第二版 刘国琴 张曼夫主编第四章 蛋白质的分离与鉴定 详细说明了蛋白质的分离与鉴定 内容包括蛋白质性质、蛋白质分离纯化、蛋白质鉴定

蛋白质的分离与鉴定

• 一、蛋白质酸碱性质
  • （一)、蛋白质性质
    • 蛋白质分子中有游离的末端a-氨基和a-羟基以及不同氨基酸侧链上的羧基、氨基、咪唑基、胍基、巯基等功能基团，这些基团在一定条件下可发生解离
    • 蛋白质和氨基酸一样也是两性电解质，所带电荷的性质和数量，即与分子中氨基酸残基的种类和数量有关，也与溶液的pH有关
    • 在相同的pH条件下，等电点不同的蛋白质，所带电荷的性质和数目不同
  • （二）、蛋白质溶解度
    • 蛋白质按溶解度分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、组蛋白、鱼精蛋白和硬蛋白七类
    • 这些蛋白溶解度依次下降，其中清蛋白溶解度最高，不仅溶于稀盐、稀酸、稀碱，还溶于水；谷蛋白（即通常说的面筋）溶于稀酸、稀碱，但不溶于水；硬蛋白，如角蛋白、胶原蛋白溶解度最差
  • （三）、蛋白质大小和形状
    • 蛋白质形状不同，有球形（溶解度比较高）、椭球形、细棒状或纤维状（溶解度较低）等
    • 球形蛋白因表面含有比较多的亲水氨基酸残基，溶解度高
    • 纤维桩蛋白不对称性高，黏度高，一半溶解度差
  • （四）、蛋白质胶体性质
    • 蛋白质分子直径一般为1~100nm，正好处于胶体颗粒质点范围，因此，蛋白质溶液属于胶体溶液
    • 胶体溶液中的蛋白质分子具有一定的稳定性，一般不会发生聚集而形成沉淀
      • 蛋白质分子表面有许多极性基团，可以吸附水分子，迫使水分子在蛋白质分子表面形成一个连续的水化层，从而阻止蛋白质分子彼此靠近形成沉淀
      • 在pH远离蛋白质pl的溶液中，同种蛋白质分子带有同种电荷，这会增加分子间的彼此排斥，进一步阻止蛋白质发生聚集
    • 如果破坏了蛋白质胶体颗粒的水化层或者使蛋白质溶液处于等电点pH，蛋白质便会发生沉淀
  • （五）、蛋白质免疫化学性质 （抗原抗体特异性结合）
    • 抗原
      • 蛋白质分子是一类主要的抗原物质
    • 抗体
      • 抗体是由抗原刺激免疫系统后产生的能与抗原发生特异结合的糖蛋白，又称免疫球蛋白
    • 抗体的基本特性
      • 特异性：某一种抗体只能与相应的抗原发生结合
      • 多样性：抗原不同，产生的抗体就不同；有多个抗原觉得簇的抗原产生的抗体也不相同
      • 不均一性：由同一个抗原决定簇产生的抗体有多种类型
      • 双重性：既可以作为抗体与相应抗原结合，也可以作为抗原再制备相应抗体，即常说的 第二抗体，简称二抗
    • 用途
      • 将抗体分子（通常用二抗）共价连接上荧光基团，可用来定位细胞中某种微量存在的抗原，这便是免疫荧光标记
      • 将酶（如辣根过氧化物酶）共价连接于抗体上，可用来测定溶液中微量存在的抗原，这便是酶联免疫吸附测定（ELISA)
      • 利用酶标抗体对电泳分离的蛋白质条带进行鉴定，这便是免疫印迹
      • 用抗体去“垂钓”、富集混合蛋白质溶液中的某种蛋白，这便是免疫沉淀
• 二、蛋白质分离纯化
  • （一）、根据溶解度差异分离蛋白质
    • （1） 等电沉淀
      • 当溶液的pH等于某蛋白质等电点时，该蛋白质分子所带的净电荷为0， 此时，蛋白质分子间失去了同种电荷的排斥作用，极易聚集而发生沉淀
      • 蛋白质在等电点时溶解度最小
      • 通过调节pH到某一蛋白质的等电点，可以将该蛋白分离出来
    • （2） 盐溶与盐析
      • 盐溶：往水中加入少量无机盐时，溶解度会明显增加。低浓度中性盐增加蛋白质溶解度的现象
      • 盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，蛋白质便会沉淀下来
      • 最常用的中性盐是硫酸铵（NH4)2SO4
        • 硫酸铵的优点是：它是二价离子，同样浓度时离子强度高，降低蛋白质溶解度更有效；溶解度大，温度系数小，在低温下（4°C）仍可以高浓度存在，这不仅能有效争夺溶液中的水以及蛋白质水化水，还满足了低温下沉淀蛋白质的需要，使蛋白质在保持活性的情况下很容易分离出来
    • （3） 有机溶剂沉淀
      • 与水互溶的极性有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇等，在高浓度下可使蛋白质产生沉淀
      • 大多数蛋白质在有机溶剂作用下容易变性
      • 低温试剂（如-20°C丙酮）有利于蛋白质活性保持
    • （4） 蛋白质变性沉淀
      • 蛋白质结构不同，能够耐受的温度不同，因此，利用加热可使某些蛋白质变性沉淀，而使另一些蛋白质仍处于可溶状态
      • 有机酸沉淀
        • 常见有三氯乙酸沉淀
        • 在酸性条件下，蛋白质分子带正电荷，很容易与有机酸的酸根负离子结合形成不溶性沉淀。在酶促反应后，加入高浓度的三氯乙酸不仅能破坏酶蛋白的分子结构，终止酶反应，还能使酶沉淀下来从而方便清除
  • （二）、根据分子大小差异分离蛋白质 (相对分子质量）
    • （1） 透析和超滤
      • 透析
        • 透析是根据分子大小、利用半透明选择性除去某些小分子物质的技术
        • 常见半透膜由醋酸纤维素制成
        • 将蛋白质溶液装入用半透膜制作的透析袋，悬于大量透析液中，在搅拌条件下，透析袋内的小分子或离子通过半透膜很快扩散除去，而大分子滞留在里面
        • 通过多次更换透析液，可除去溶液中的小分子。透析法常用于除去蛋白质溶液的盐组分（除盐）
      • 超滤
        • 将蛋白质溶液装入带有半透膜的超滤装置，通过加压、减压或离心，水分子便穿过半透膜快速离开，大分子蛋白被截留浓缩
        • 超滤法炒作简单，能较好地保存生物大分子的活性，回收率高
    • （2） 密度梯度离心
      • 不同蛋白质颗粒在质量、密度和形状上存在差异，在一定的强离心力场中表现出不同的下沉速度--沉降速度
      • 蛋白质之间的超离心分离常采用的离心介质是蔗糖密度梯度
        • 即在离心管中按一定操作装入蔗糖溶液，使蔗糖溶液浓度从离心管底部到顶端渐渐降低，然后将蛋白质溶液加在梯度介质顶端进行超离心
        • 在超离心力场中，蛋白质颗粒质量和密度越大，沉降速度越快，反之越慢
      • 沉降超离心通过超离心使不同颗粒以不同速度往下沉降的技术
    • （3） 凝胶过滤层析
      • 凝胶过滤又称为分子筛层析或排阻层析，是利用固定相内一定大小的网孔对相对分子质量不同的组分的阻滞程度不同而进行蛋白质分离的层析技术
      • 凝胶过滤层析柱的填料为不溶于水但又能高度水化的珠状碳水化合物聚合体，如交联葡聚糖。典型的凝胶柱直径为0.1mm，内部为充满水的网孔
      • 将蛋白质样品加在柱床表面，当用缓冲剂洗脱时，比凝胶珠网孔大的蛋白质不能进入凝胶珠内部，只从凝胶珠的间隙里通过，受到阻滞作用小，经过的路径短，先被洗脱下来；比凝胶网孔小的蛋白质则容易进入凝胶颗粒内部，受到的阻滞作用大，经过的路径长，后被洗脱下来（分子量大的先出，小的后出）
      • 凝胶过滤层析不仅用于蛋白质的分离纯化，也常用于除去蛋白质溶液中的无机盐等小分子物质（除盐、测相对分子质量）
  • （三）、根据电荷不同分离蛋白质
    • 1、电泳
      • 在溶液中，蛋白质分子由于氨基酸残基的解离而带电荷； 在电场中，蛋白质带电粒子会向与自身电荷相反的电极泳动，这便是电泳
      • （1)、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
        • 以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质进行电泳，即聚丙烯酰胺凝胶电泳
        • 聚丙烯酰胺凝胶多采用垂直板、不连续系统
        • 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质分离效果好，主要基于3种物理效应
          • 浓缩效应 ：点样孔中的样品液中蛋白质分散存在，通电后，它们在大网孔浓缩胶中快速前行，当接触到分离胶后被阻滞、压缩成一薄层，从而使所有蛋白质公平位于同一个“起跑线”上，再进入分离胶
          • 电荷效应：在较高pH下，所有蛋白质带负电，在同一电场中可向正极移动；带负电荷越多，移动速度越快
          • 分子筛效应：蛋白质分子越大，不对称性越高，在网状凝胶中受到的阻力越大，就越靠近凝胶上端；反之，则更靠近凝胶下端
        • 电泳过程中通常加入溴酚蓝试剂指示电泳前沿。溴酚蓝分子带负电，比蛋白质小，迁移速度快，总是位于蛋白质前面。当前沿指示剂接近凝胶底边时及时停止电泳，取出凝胶进行考马斯亮蓝染色，蛋白质条带便清晰显示出来。
      • (2)、等电聚焦电泳（IEF)
        • 等电聚焦电泳是根据蛋白质等电点不同而分离、鉴定蛋白质的一种电泳技术
        • 在电泳凝胶中加入两性电解质，施加电场后，各组分移动并停留在各自的等电点位置；等电点低的靠近阳极，等电点高的靠近阴极，由此形成一个连续pH梯度
        • 蛋白质也属于两性电解质，在电场中各蛋白质分子依据电荷性质和数量在凝胶中移动，当移动到等电点区域时，便停留在那里形成很窄的区带
        • 用等电聚焦电泳即可分离蛋白质，也可进行蛋白质等电点的测定
      • (3)、双向电泳（2-D）
        • 双向电泳是一种在二维方向上对同一蛋白样品先后进行两种不同性质的电泳，目的是分离高分辨率的蛋白质
        • 最常见的双向电泳有IEF/SDS-PAGE
          • 先将蛋白质样品在一维方向上进行等电聚焦凝胶电泳，使蛋白质按等电点分离成条带
          • 然后换用SDS-PAGE在二维方向上电泳，使位于同一条带中的蛋白质再按分子质量展开
          • 由此得到的电泳凝胶经银染后，所有蛋白质亚基便在一个平面上呈斑点状分布
        • 应用：是蛋白质组学研究中非常有用的技术
          • 蛋白质组：一个细胞或一种生物在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质
          • 蛋白质组学就是专门研究一个细胞或一种生物所有蛋白质的新兴学科，以了解蛋白质在不同条件下、不同发育时期的是空表达规律或蛋白质结构修饰变化等
    • 2、离子交换层析
      • 蛋白质的离子交换层析和氨基酸的离子交换层析基本原理相似，所不同的是层析介质。蛋白质离子交换层析介质主要由两部分组成：
        • 一部分是亲水性强且能够形成大网孔的惰性固体支持物，如纤维素、葡聚糖及琼脂糖
        • 另一部分是与之共价链接的可解离基团
      • 蛋白质所带电荷的种类和数目不同，与层析介质的结合力不同
      • 首先用大量洗脱剂洗出来未结合的杂蛋白，然后逐步提高洗脱剂离子强度（或改变pH），结合在凝胶上的蛋白质便按照结合力从弱到强的顺序依次洗脱下来。分部收集洗出液，即可获得分离的蛋白质。
  • (四）、根据蛋白质吸附特性分离蛋白质
    • 吸附层析：利用层析介质表面的活性基团对流动相中不同组分吸附性能差异进行分离的方法
    • 1、羟基磷灰石层析
      • 以羟基磷灰石层析作为吸附剂，在低浓度磷酸缓冲液及低pH条件下，大多数蛋白质能与羟基磷灰石结合
      • 通过提高洗脱剂磷酸根浓度或pH，能把吸附力渐强的蛋白质依次洗脱下来
    • 2、疏水作用层析
      • 使用带有较强疏水基团（苯基、幸基、丁基等）的吸附剂进行的层析即为疏水作用层析
      • 不同蛋白质与吸附剂的疏水相互作用强弱不同，因而可以被分离
  • (五)、根据生物分子特异亲和力分离蛋白质
    • 亲和层析：利用生物分子与特异配基专一、可逆结合的特性分离大分子的层析技术
    • 首先将特异配基共价键链接到惰性凝胶（如葡聚糖、琼脂糖等）颗粒上制成亲和层析介质
    • 当蛋白质混合物流经亲和层析介质时，只有目标蛋白能与配体结合；用缓冲液洗脱除去未结合的杂蛋白，最后改变洗脱条件（如缓冲剂中加入游离配体），把目标蛋白质洗脱下来
    • 以抗原为配基纯化抗体，以第五位配基分离酶，以糖为配基分离凝集素，以核酸为配基分离核蛋白，以激素信号分子为配基分离受体蛋白等，都是常见的亲和层析
• 三、蛋白质鉴定
  • （一）、蛋白质分子质量鉴定
    • 1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
      • 在β巯基乙醇存在下，蛋白质二硫键断裂，多肽链充分伸展，SDS以其烃链在蛋白质分子的侧链通过疏水相互作用结合成复合体
      • SDS是蛋白质变性剂，它可以破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质发生变性（蛋白质只有三级结构）
      • SDS与蛋白质的结合带来了两个后果：
        • 由于SDS是阴离子，大量SDS分子的引入导致蛋白质分子带上大量负电荷，而使得蛋白质分子原有的电荷较之可以忽略，这样就消除不同蛋白质分子原有电荷差异
        • 蛋白质结合SDS后天然构象发生变化，通常转化为椭棒状，这样就消除了不同蛋白质分子在形状上的差异
      • 在SDS存在下，蛋白质在电场中泳动时其迁移率仅与蛋白质分子质量有关。 二者关系式为：蛋白质分子质量的对数与蛋白质迁移率成线性负相关
      • 在同一块电泳凝胶上对一组已知分子质量的标准蛋白质和蛋白质样品分别进行SDS-PAGE分析；以标准勋蛋白质的迁移率为横坐标，以分子质量对数为纵坐标绘制标准曲线；从未知蛋白质的迁移率即可求出蛋白质亚基的分子质量
      • 用SDS-PAGE分子蛋白质分子质量，灵敏度高，微量样品即可， 用考马斯亮蓝染色可分析微克级蛋白质，用银染法可分析纳克级样品
      • SDS-PAGE的另一个特点是它属于变性电泳，结果显示的是蛋白质亚基分子质量
    • 2、凝胶过滤法
      • 凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关（测相对分子质量、分离蛋白质、除盐）
      • 先测得几种标准蛋白质的Ve（Ve为洗脱体积），并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量
    • 3、沉降速度法
      • 利用蛋白质沉降速度的差别不仅可以分离蛋白质，还可以分析蛋白质大小
      • 在一定的离心条件下，每一种蛋白质分子将形成一条特定的区带，以一定速度向下沉降
      • 每单位离心力场的沉降速度称为沉降系数（“S”)
  • （二）、蛋白质免疫印迹分析
    • 免疫印迹分析是一种利用凝胶电泳分离和抗原-抗体特异结合原理对蛋白质进行定性分析的现代生物化学技术
      • 先将蛋白质样品进行凝胶电泳分离，获得电泳胶；在凝胶上平铺一层硝酸纤维素滤膜，而后在凝胶一侧加负极，在滤膜一侧加正极，将蛋白质从凝胶电转移到滤膜上
      • 先后加入特异性抗体和酶标二抗分别进行孵育结合；最后洗脱除去非特异结合的抗体，利用二抗上结合的标记分子（如辣根过氧化物酶）使目标蛋白条带显色
    • 由于抗原-抗体反应的专一性和酶反应的高效性，利用免疫印迹技术可以有效鉴定出样品中某蛋白质是否存在，从而使蛋白质分到定性分析
    • 用ELISA法也可以对溶液中微量存在的蛋白质样品进行定性或定量分析
      • ELISA依据的是蛋白质的吸附能力和抗原-抗体特异结合原理
      • 首先将某种蛋白质（抗原）溶液加到数量点滴板孔中，使蛋白质吸附到孔壁上；然后用特异抗体（一抗）与之结合，再用酶标二抗与一抗结合，最后进行显色
      • 由于酶的催化具有高效性，微弱的抗原信号也能被检测出来
  • （三）、蛋白质定量分析
    • 1、双缩脲反应
      • 双缩脲反应：双缩脲是由两分子尿素结合成的化合物，分子中的两个（CO-NH：肽键）在碱性溶液能与Cu2+反应生成紫红色络合物，称为双缩脲反应
      • 多肽和蛋白质含有两个以上肽键，因此可发生双缩脲反应
      • 该反应稳定，操作简便，但灵敏度较低，适于测定蛋白质浓度较高的样品
    • 2、Folin-酚反应
      • Folin-酚试剂法（Lorry法）是测定可溶性蛋白的标准方法
      • 该法是在双缩脲反应基础上，再加入酚试剂（含磷钼酸及磷钨酸）进一步反应。蛋白质络氨酸酚羟基实际还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），因而可使反应灵敏度提高一个数量级
      • 不同蛋白质因络氨酸含量不同而使显色强度稍有不同
    • 3、考马斯蓝结合反应
      • 考马斯蓝分子含有6个苯环和2个负电荷基团，通过范德华力、疏水作用和静电力可与蛋白质进行物理性结合
      • 结合后的考马斯亮蓝颜色发生变化，故通过比色可定量蛋白质（蛋白质多，颜色深，反之）
      • 此法操作简单，反应灵敏，可测微克量级蛋白质样品
      • 有不同类型考马斯亮蓝：考马斯亮蓝R-250为三甲基甲烷衍生物； 考马斯亮蓝G-250比R-250多2个甲基
        • 由于R-250比G-250灵敏度高，常用于电泳凝胶上的蛋白质染色
        • 在蛋白质浓度高时，R-250显色不符合Beer定律，因此常用G-250定量溶液中的蛋白质。利用考马斯亮蓝G-250结合法定量蛋白质又叫Bradfolf法
  • （四）、蛋白质纯度测定
    • 最方便的方法是SDS-PAGE。电泳胶染色后仅一条带，说明该蛋白质样品达到了SDS-PAGE纯度。如果有多条带，通过对电泳凝胶扫描和软件分析，可以计算出目标蛋白质的纯度