导图社区 生物化学 蛋白质结构与功能
农学考研 生物化学 第二版 刘国琴 张曼夫主编 蛋白质结构与功能 详细讲述了蛋白质一级结构、二级结构、三级结构、四级结构的主要内容
编辑于2022-06-21 15:36:35蛋白质结构与功能
概述
凯氏定氮法:蛋白质含有机氮,而且氮含量平均为16%
蛋白质*16%=含氮量
蛋白质的分类
简单蛋白质:完全由氨基酸组成
缀合蛋白质:除氨基酸组成的蛋白质部分外,还有非蛋白质成分——辅基
蛋白质具有不同的生物功能
1、酶催化作用
2、运输和储藏
3、细胞运动
4、机械支撑作用
5、免疫保护
抗体
6、调控作用
激素
蛋白质结构通常分为4个层次
一级结构属于初级结构,指多肽链氨基酸顺序和二硫键位置
二、三、四级结构属于蛋白质高级结构
蛋白质一级结构是构成高级结构的基础,高级结构决定蛋白质功能
一、蛋白质一级结构
一、氨基酸以肽键链接形成蛋白质
蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链的氨基酸顺序以及二硫键的位置
蛋白质由许多氨基酸按一定顺序连接而成,各氨基酸之间以肽键相连。肽键是由一个氨基酸的a-羧酸与另一个氨基酸的a-氨基发生缩合反应,脱去一分子水形成酰胺键。
肽键连同与之相连的4个原子(羰基氧、氨基酸和2个a-碳原子)称为肽基
肽基有3个基本特征
1、肽基呈刚性平面结构
肽键并非典型的单键,也不是典型的双键,而是具有部分双键性质
这是由于酰胺氮上的孤电子对羰基之间发生了共振相互作用,使肽键呈共振杂化体结构
部分双键性质使得肽键不能自由旋转,导致肽基上的所有原子共处于一个平面上,即所谓肽平面或酰胺平面
2、肽基具有极性(极性:上下不对称)
3、大多数肽基为反式构象
二、多肽链的方向性及大小
多个氨基酸通过肽键按顺序连在一起就形成了多肽链,其中每个氨基酸单位称为残基
方向性:它的两个末端是不同的,一端为游离的a-NH3+,称为氨基端或N端;另一端为游离的a-COO-,称为羧基端或C端
书写多肽链时,习惯上将N端氨基酸残基作为起始端,按从左到右的方向写出多肽链中氨基酸的排列顺序,可以三字母形式表示,如AlaGlyGlyTyr,也可以单字母形式表示,如AGYGY
由两个氨基酸残基组成的称为二肽,由三个氨基酸残基组成的称为三肽......一般吧含有几个至几十个氨基酸残基的肽称为寡肽,把更长的称为多肽
活性肽
谷胱甘肽(GSH)
其分子是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽,活性基团为巯基
在谷胱甘肽分子中,谷氨酸和半胱氨酸之间的肽键为异肽键,城建的羰基来自谷氨酸的γ-羧基,而不是a-羧基。为了突出这一点,谷胱甘肽常表示为γ-谷胱甘肽
在红细胞中,谷胱甘肽不仅可以作为巯基缓冲剂,维持血红蛋白或其他巯基酶Cys残基处于还原状态,还可以用于消除脂质过氧化物对细胞膜的破坏,是生物体很好的氧化还原缓冲剂。(还原性的谷胱甘肽 “解毒”乙肝)
缬氨霉素
是一种常见抗生素
缬氨霉素是钾离子(K+)载体,能协助K+跨膜扩散,破坏细胞膜两侧的K+浓度,因而有杀菌作用
三、蛋白质的氨基酸顺序具有特异性
牛胰岛素是世界上首例被测定氨基酸顺序的蛋白质
英国生物学家F.Sanger历时十多年,通过2,4-二硝基氟苯(DNFB)和多肽链氨基末端反应(桑格反应)并结合纸层析等方法,于1953年测定出牛胰岛素的氨基酸顺序
胰岛素由两条多肽链组成
A链含有21个氨基酸残基,B链含30个氨基酸残基,各氨基酸残基有严格的顺序。整个蛋白质含有链间二硫键,一个链内二硫键。
四、蛋白质序列测定
(一)、直接测序法
整体步骤策略
1||| 制备测序蛋白质样品
首先获得蛋白质纯品,测定出蛋白质由几条多肽链组成;然后分离出不同多肽链,并针对每一条多肽链测定出氨基酸组成
2||| 对多肽链进行分段测序
为了保证测序结果的准确性,对于比较长的多肽链要进行特异水解,获得一套大小适中的肽段,然后利用Edman降解法对各肽段进行氨基酸顺序测定。为明确各肽段之间的先后顺序,需要用两种以上的有限水解方法对多肽链进行处理,获得多套肽段并测序
3||| 拼凑完整多肽链的一级结构
根据每套肽段中各肽段的氨基酸顺序以及多套肽段之间的重叠区,拼凑出整个多肽链的氨基酸的顺序。如果有二硫键,还要确定其位置
1、多肽链末端氨基酸残基分析
N端氨基酸残基分析
氨肽酶法
氨肽酶是一类肽链外切酶,简称外切酶,专门从N末端开始逐个水解肽键。通过控制酶反应速度,可以分离、鉴定出N端氨基酸
外切酶:一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。(从N端开始:氨肽酶;C端:羧肽酶) 内切酶:一种能催化多核苷酸的链断裂的酶,只对脱氧核糖核酸内一定碱基序列中某一定位置发生作用,把这位置的链切开。
由于酶反应速度很难严格控制,因此,该法在实际应用中有较大局限性
桑格法
DNFB在弱碱性反应条件下与多肽链N端氨基酸残基的a-氨基反应生成DNP-肽;新形成的共价键比肽键稳定,进行酸水解时,黄色的DNP-氨基酸释放下来,其他则水解为自由氨基酸。结合层析即可鉴定出多肽链N端氨基酸残基
丹磺酰氯法
丹磺酰氯是一种荧光试剂,能专一性地与多肽链N端的a-氨基反应,生成稳定的丹磺酰蛋白质(DNS-肽);肽键经酸水解释放出游离氨基酸,结合层析或电泳技术,即可鉴定出带荧光的DNS-氨基酸
Edman降解法
在弱碱条件下,多肽链N端a-氨基与PITC反应,生成无色的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-AA),结合层析技术可快速确定氨基酸的性质
Edman降解法有一个突出特点,就是不仅可以用来测定多肽链N端氨基酸,还可以通过循环反应、重复抽提和氨基酸层析分析,将剩余多肽链的氨基酸按顺序一一测定出来
C端氨基酸残基分析
羧肽酶法
羧肽酶也属于外肽酶(外切酶),专门水解羧基末端肽键,释放出C端氨基酸
如果羧基末端是脯氨酸时,羧肽酶无法作用
肼解法
弱酸条件下,多肽链与肼反应20h,此时所有肽键发生肼解,羰基与肼以酰胺键链接,各种氨基酸残基生成酰肼,只有C端氨基酸残基除外,结合层析即可鉴定出该氨基酸
2、多肽链的分离
首先需要打断多肽链之间或多肽链内部的二硫键
最常用的断裂方法是用β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)处理
由此形成的自由巯基,容易再氧化成二硫键,为防止这种情况产生,常采用碘乙酸进行保护
3、多肽链氨基酸组分分析
首先将多肽链进行彻底水解,释放出自由氨基酸
酸水解
酸水解的有点是产物仍为L-氨基酸,缺点是色氨酸被破坏,羟基氨基酸和酰胺类氨基酸受到不同程度破坏
减水解
碱水解的有点是色氨酸稳定,缺点是产物中除L-氨基酸,还有D-氨基酸,有消旋现象,而且大多数氨基酸被破坏
多肽链彻底水解后,可利用层析技术对氨基酸进行鉴定
蛋白质氨基酸组分分析已经实现自动化,所用仪器叫做氨基酸自动分析仪
这是一种将氨基酸标记反应(如生成PTC-氨基酸)和例子交换层析相结合的技术,通过测定洗脱峰的位置定性氨基酸,通过测定紫外吸收值(来自标记的PTC)定量氨基酸
4、多肽链的专一性裂解
用于测序的多肽链长度一般不宜超过50个氨基酸残基
酶法(内切酶)
胰蛋白酶专门水解由赖氨酸或精氨酸的羧基形成的肽键
胰凝乳蛋白酶专门水解由芳香族(Tyr、Trp、Phe)(或具有打的疏水侧链)氨基酸的羧基形成的肽键
化学法
最常用的化学裂解药物是溴化氢(CNBr),可专一性水解Met的羧基形成的肽键
5、肽段氨基酸序列测定
肽段氨基酸序列的测定一般基于Edman降解原理
6、蛋白质氨基酸顺序的拼接与二硫键的确定
根据一套肽段中每个肽段的序列,并结合另一套肽段中重复肽的氨基酸顺序,很容易拼接出整个多肽链的顺序
如果蛋白质中存在二硫键,还需要测定二硫键的位置
传统的测定方法是进行对角线电泳
(二)、串联质谱法
质谱(MS)是根据带电粒子的质荷比不同而对物质进行鉴定的一种技术
质谱法可用来鉴定多肽链的分子质量
串联质谱能用于多肽链测序
(三)、推定法(遗传密码)
五、蛋白质数据库与蛋白质序列比对分析(简答)
蛋白质数据库:uniport
一级结构是蛋白质的重要结构。蛋白质一级结构相同,生物功能就相同;但生物功能相同,一级结构并非完全相同。一类蛋白质中往往只要具备了一定的“同源序列”,表现出一定的结构相似性,就能执行同样的生物功能。
一级结构相似的蛋白质,功能相似(如血红蛋白→运输氧)
存在于不同生物中的一组序列和功能想死的蛋白质互称同源蛋白。同源蛋白之间在进化上有亲缘关系。序列相似性越高,进化关系越近;反之,进化关系越远。
如人和猪的血红蛋白功能是:运输氧,但实际是序列不同但相似
在同源蛋白中,有些位点的氨基酸残基在进化上比较保守(不变),称为不变残基或保守残基,它们对蛋白质特定结构和功能非常重要,如果发生突变,蛋白质极易丧失正常功能;有些位点的氨基酸残基可以发生改变,称为可变残基
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲缘关系和进化。来自两个物种间的同源蛋白质,其序列间的氨基酸差异数目与物种系统发生差异成正比。亲缘关系越远,同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大
在可变残基中,有些只能在同类氨基酸之间发生保守性替代,如Glu→Asp,Leu→Ile等。可变残基对蛋白质的结构和功能没有特殊影响,一般只在物种进化中起作用,与免疫性有关。
在物种进化中起作用:决定物种特异性(如血红蛋白,在人体中可能是Glu,在猪当中可能是Asp,瞎掰举例,仅供参考)
二、蛋白质二级结构
细胞中的天然蛋白质并非以伸展的一级结构形式存在,而是形成特定空间构象
一、X射线衍射技术
用X射线衍射技术分析蛋白质的构象,需要蛋白质首先形成晶体
用核磁共振技术也可分析蛋白构象,对蛋白质样品没有晶体要求
圆二色、萤光偏振、拉曼光谱等技术都曾用于蛋白质的局部 构象分析
二、多肽链折叠的空间限制
蛋白质多肽链在形成构象时具有很大的局限性,主要受限于相邻氨基酸残基R侧链产生的空间位阻
三、蛋白质二级结构
定义
蛋白质二级结构:多肽链借助氢键沿一维方向所形成的周期性结构
a-螺旋和β-折叠是蛋白质分子中两种主要的二级结构类型
1、a-螺旋
a-螺旋指多肽主链借助氢键紧密卷曲而成的周期性螺旋状构象
每个a-螺旋含有3.6个氨基酸残基,螺距未0.54nm,相邻氨基酸轴向距离为0.15nm
a-螺旋为右手螺旋(顺时针),其中每一个氨基酸的C=O和它前面第四个氨基酸残基的N-H形成氢键,氢键方向和螺旋轴的方向基本一致
由每一个氢键闭合形成的环包含13个原子,因此,a-螺旋又叫3.613-螺旋
Pro由于无酰胺氢,不能形成链内氢键,它的出现往往应起a-螺旋的终止
a-螺旋是常见的一种
2、β-折叠
β-折叠:两条或多条(通常为2~5条)几乎完全伸展的多肽链或同一多肽链之中的不同肽段,靠氢键侧向聚集在一起形成的片状结构
Val和ile最易形成β折叠
3、非重叠性二级结构
β-转角
β-转角:链接β-折叠片的一类回折结构
Pro具有环状结构,有利于β-转角的形成
Gly侧链很小也常出现在β-转角中
四、蛋白质超二级结构
水溶性差
超二级结构:由若干个相邻二级结构形成的具有一定规律的组合体
常见的超二级结构
超二级结构广泛存在于各种球状蛋白质结构中。在许多纤维状蛋白质分子中,如角蛋白,胶原蛋白和丝心蛋白等,则以超二级结构为基本结构形式,这赋予纤维蛋白特殊的功能
1、角蛋白
a-角蛋白:由a-螺旋结构组成的
毛发a-角蛋白,是由三股右手a-螺旋相互缠绕形成的左手超螺旋,属于aaa组合的超二级结构
毛发能够抗一定张力,还可以抗拉伸,这一方面源于它的紧密螺旋结构,另一方面源于螺旋间存在的一些二硫键
a-角蛋白在湿热条件下可以转化为β-角蛋白——是一种更为伸展的构象
烫发
烫发后涂上还原剂并加热,这个过程二硫键将被破坏
洗去还原剂,涂上氧化剂,二硫键按卷曲后的位置重新组合
相邻多肽链的半胱氨酸残基对在卷曲处发生了”错位“从而形成了卷发
2、胶原蛋白
基本结构是三螺旋或称胶原螺旋
最典型的胶原蛋白1是由三股平行而伸展的左手螺旋靠范德华力和氢键拧成的右手三螺旋
其氨基酸组成具有特异性,由(Gly-X--Y)重复连接而成;其中X多为Pro,Y多为羟脯氨酸(Hyp)或羟赖氨酸,这两种稀有氨基酸分别由pro和Lys经羟基化修饰转变而来
Gly侧链只是一个氢原子,其大量出现便于形成紧实的螺旋结构
3、丝心蛋白
丝心蛋白一级结构含有6个残基的重复序列:Gly-Ser-Gly-Ala--Gly-Ala
由β-折叠结构组成
丝心蛋白是蚕丝、蜘蛛丝的主要成分
三、蛋白质三级结构(一条链)
概述
蛋白质三级结构是指一条多肽链借助各种次级键折叠成的具有特殊肽链走向的紧实构象。次级键包括疏水作用力、氢键、离子键、范德华力,其中以疏水作用力的作用最为突出(二级结构:氢键;一级结构:二硫键和肽键)
解释 疏水作用力:物以类聚,人以群分;疏水聚一起,亲水聚一起(瞎掰举例,仅供参考)
多肽链折叠为三级结构后,疏水氨基酸残基多集中于分子内部,而亲水氨基酸残基多分布在分子表面
结构域:在比较大(含200个以上氨基酸残基)的蛋白质三级结构中,往往出现一个以上相对独立的紧密结构区域
结构域之间的肽链称为铰链区,具有一定柔性。铰链的存在不仅有助于蛋白质与其它分子的互作,还有利于分子内两个结构域之间的互作
一、多肽链的折叠与蛋白质变性
多肽链的折叠
多肽链折叠有的为快速自发过程,有的则需要由一类称为分子伴侣的蛋白辅助完成,或有异构酶参与
蛋白质变性
蛋白质变性:天然蛋白质分子当收到某些过激3的物理因素或化学因素的影响时,次级键会被破坏,导致天然构象解体,生物活性丧失,这个过程称为蛋白质变性
物理因素:高热、高压、紫外线、X射线、超声波、过度搅拌
化学因素:强酸、强碱、重金属盐、三氯乙酸
理化性质有明显的改变
溶解度降低,扩散系数降低,黏度增加,对蛋白酶的水解更铭感等
蛋白质的复性
蛋白质复性:对于单一蛋白质,如果变性条件不剧烈,除去变性因素后,蛋白质还可恢复其天然构象和生物学活性
常见的蛋白质变性剂
SDS
SDS即十二烷基硫酸钠,为表面活性剂,能破坏蛋白质疏水相互作用,使非极性基团暴露
盐酸胍、尿素
8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍能破坏蛋白质的非共价键(次级键),尤其氢键
最典型的蛋白质变性-复性实验 前提因素:一级结构未被破坏
牛胰核糖核酸酶为单条多肽链折叠成的球状构象,含有124个氨基酸残基,分子中有4个二硫键
在8mol/L尿素(破坏次级键)和巯基乙醇(破坏二硫键)后存在时,牛胰核糖核酸酶左右的二硫键断裂,多肽链自由伸展呈无规则卷曲,酶变性失活
当用透析法除去变性剂和巯基乙醇后,多肽链会自动折叠成原来的构象,4个二硫键又在特定半胱氨基酸之间形成。酶活性得到恢复,各项物理、化学性质和天然酶的完全一致
在复性的反应系统中保持微量的巯基乙醇可以为错配的二硫键提供纠错机会,最终形成稳定的天然构象
Anfinsen对牛胰核糖核酸酶的变形-复性实验说明
决定蛋白质天然构象的信息来源于多肽链氨基酸的顺序
话句话说,蛋白质的一级结构决定高级结构
二、肌红蛋白的结构与功能
肌红蛋白(Mb)的生物功能是在肌肉中储存和供应氧
肌红蛋白由一条多肽链和血红素组成
血红素由一个有机分子和一个Fe原子组成
肌红蛋白最突出的特点是分子表面由一个由多肽链折叠成的疏水裂缝(或凹穴),裂缝中嵌有血红素
四、蛋白质四级结构(多条链聚集体)
概述:
四级结构:多个多肽链以球状亚单位形式缔结在一起,形成一个有功能的聚集体形式
四级结构中的每个亚单位称为亚基或单体
同聚体:由相同亚基组成的蛋白质;异聚体:由不同亚基组成的蛋白质
四级结构中各亚基之间主要通过非共价键缔结在一起,其中疏水相互作用贡献最大,范德华力最小,氢键和离子键则提供了亚基间特异结合的作用力。有些蛋白质在亚基间还存在二硫键
一、血红蛋白(Hb)的四级结构
血红蛋白存在于红细胞内,作为载体将氧从肺部经血液运送给各代谢组织
血红蛋白由2个a亚基组成,为a2β2异四聚体
二、氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白构象不同
血红蛋白是别构蛋白(构象可以改变),它在结合氧前后构象不同
脱氧时,血红蛋白的构象为紧张态称为T-态
T-态构象对底物亲和力比较低(很难再跟氧气结合)
当氧与血红蛋白分子中的一个亚基结合时,整个分子各亚基从紧张态转变为松弛态,既R-态构象
R-态构象对底物亲和力高
三、血红蛋白亚基间有协同效应
红细胞中的血红蛋白的氧合曲线是S形, 而肌红蛋白氧合曲线是双曲线
在低氧分压下肌红蛋白和氧气有较强亲和力,能在低氧环境中对氧浓度变化做出敏感反应,这完全适合肌红蛋白在肌肉中储氧,供氧作用。
血红蛋白不一样,在低氧分压时氧饱和度很低,容易卸载氧
血红蛋白呈S形曲线的氧结合特征主要源于亚基间的别构效应,具体来讲是协同效应
别构效应是指多亚基蛋白(或酶)因某效应物与之结合而导致自身构象和活性发生变化的现象(改变构象,影响功能)
血红蛋白的4个亚基在结合氧时不时独立进行的,其中一个亚基与氧结合可触发其他亚基由T-态(紧张态)构象转变为R-态(松弛态)构象,从而增加血红蛋白与氧的亲和力
血红蛋白分子中亚基间的别构效应存在促进关系,因而称为协同效应。 协同效应是血红蛋白呈现S形氧合曲线的重要原因之一
四、H+、CO2、以及BPG(2,3-二磷酸甘油酸)对血红蛋白结合氧的影响
低pH和高浓度CO2降低血红蛋白的氧亲和力
波尔效应具有重要的生理意义
代谢旺盛的组织(如收缩的肌肉)产生高水平的CO2,pH约7.2,有利于血红蛋白释放氧,结合CO2
在肺部血中,pH约7.6,有利于血红蛋白与氧结合,卸载CO2
2,3-BPG降低血红蛋白的氧亲和力
在生理条件下,2,3-BPG带4个负电荷,为多阴离子化合物,它与血红蛋白的两个β-链形成交联后,使血红蛋白四级结构趋向T态,不利于氧的结合
例子
胎儿的血红蛋白F有独特的结构组成,与成人血红蛋白A相比,它与2,3-BPG的结合力明显弱,这显然有利于胎儿从母亲血液获得自身生长发育所需要的氧气
一个人从海平面到达4500m高度时,在2d内红细胞中的2,3-BPG浓度从4.5mmol增到0.7mmol,血红蛋白氧合能力下降,导致血红蛋白在毛细血管中释放氧能力相应提高,即在低氧环境下血红蛋白实际运载的氧气量增加了
五、镰刀形细胞贫血病的分子基础
血红蛋白β亚基N末端的肽段出现异常,第6位Glu变成了Val(“背着6把镰刀割谷子,累了,歇一歇”)