4.法医DNA分析技术基础

法医物证学，法医DNA分析技术基础，整理了DNA提取、DNA定量、PCR（聚合酶链式反应）、DNA电泳的内容，有兴趣的可以看看哟。

法医DNA分析技术基础

• DNA提取
  • 原则
    • ①裂解细胞，释放DNA分子 ②将DNA分子与其他细胞物质进行分离 ③将DNA制备成可以进行PCR扩增等应用的形式
    • 注意事项: ①防污染 ②大分子，保持DNA分子完整性，防止其降解 ③去杂质
  • 方法
    • ①有机溶剂提取法→饱和酚-氯仿提取法
      • C裂解(碱性和螯合剂EDTA)→分离DNA(SDS和蛋白酶K)→杂质去除(苯酚和氯仿)→DNA纯化(乙醇沉淀)
        • 大分子纯度高
    • ②盐析法
      • 原理:DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，溶解度先增大后减小
        • 简便快速质量高
    • ③Chelex-100 提取法
      • Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂→螯合镁离子→核酸酶失活→保护DNA分子不被降解→煮沸碱性使膜破裂蛋白质变性→离心除去Chelex-100
      • 优点: 在一个试管内进行→无转移→减少污染降低检材损失→适合微量检材提取，简单快速 缺点: DNA纯度不高，仅适用于PCR反应模板制备
    • ④固相提取方法
      • 是一种吸附层析方法，以固体吸附剂为固定相如瓷珠颗粒，以有机溶剂或缓冲液为流动相→利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离 高盐低PH→DNA结合在固相基质，低盐或水溶液→DNA被洗脱
        • 适合从全血血痕体液及体液斑中提取DNA，特别适合自动化提取平台操作
• DNA定量
  • 为什么要PCR定量
    • ①PCR对于DNA量要求严格→过多影响数据分析解释，过少丢失或扩增失败 ②混合样本→必要采取人类特异的DNA定量方法有选择地确定DNA的量
  • 方法
    • ①紫外分光光度法（ 260nm）
      • 吸收强度与核酸浓度呈正比 (1) 10OD→双链DNA50，单链DNA或RNA40，单链寡聚核苷酸20 (2) OD260/OD280→DNA为1.8，RNA为2
    • ②琼脂糖凝胶电泳结合溴乙锭荧光测定法
      • 溴乙锭(EB)可以嵌入双链DNA分子中，在紫外线照射下呈橙色荧光→荧光强度与EB的量呈正比，被结合的EB量与核酸呈正比→主观性半定量方法，低灵敏，无人类特异性
    • ③荧光实时定量PCR技术
      • 探针(5'-荧光基团，3'-淬灭基团)→PCR每复制一个特异核酸片段就有一个探针被切断，两个基团分离→荧光基团被激活而发荧光→荧光强度=扩增循环次数→检测到的荧光信号与标准曲线对照，测定模板拷贝数，具有极高的灵敏度和人类特异性
• PCR(聚合酶链式反应)
  • 在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍
  • 原理
    • 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对寡核苷酸为引物，dNTP为合成DNA的原料，在DNA聚合酶的催化下，经过高温变性、低温退火和中温DNA链延伸三步骤的循环，使靶DNA得到复制
  • 反应体系
    • ①模板DNA：要扩增的基因片段即目的基因(1-10 ng)
    • ②一对引物：引导DNA链的合成，“引子”
      • 1）引物的碱基尽可能随机分布，G + C的含量宜在40～60%； 2）引物内部不应形成二级结构，尤其在其3′端； 3）两条引物之间，特别是3′端，不应有互补序列存在，避免形成引物二聚体； 4）引物的3′端与模板DNA一定要配对，否则影响延伸效率，以AT含量多为好，避免GC过多
    • ③热稳定的DNA聚合酶(嗜热水生菌中提纯)：催化DNA合成
      • 70-75活性最高，没有校正功能，50PCR体系中需要0.5-2.5U
    • ④四种三磷酸脱氧核苷(dNTP)：合成DNA链的原料
      • 20-200，四种浓度应均衡
    • ⑤适当的缓冲体系：镁离子(1.5mmol/L～2.0mmol/L)
      • Taq DNA聚合酶必需的激活离子；浓度影响引物退火及延伸时特异性碱基的掺入
  • 步骤
    • ①变性(高温)→目的双链DNA片段在94℃下解链
    • ② 退火(低温)：两种引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过碱基配对结合
    • ③延伸(中温)：在Taq DNA聚合酶作用下， 以目的DNA为模板进行DNA合成
  • 产物的积累规律
    • 反应初期，目的DNA片断呈指数增加，之后减慢，进入平台期
      • 原因 ①引物、原料消耗过多 ②酶活性下降；酶与PCR产物结合后，游离浓度降低 ③高浓度产物的抑制作用(使扩增产物解链不完全，降低Taq DNA聚合酶能力，非特异性产物与引物二聚体的竞争)
  • 影响因素
    • ①引物的质量
    • ②Taq DNA聚合酶
      • 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，对单核苷酸的错配无校正功能
    • ③Mg 2+浓度
    • ④dNTP浓度
      • 过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。
    • ⑤退火温度
      • 在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合 Tm=4(G+C)+2(A+T)
  • 法医学应用PCR技术特点
    • ①高灵敏(理论上可检测单个体细胞的基因组DNA) ②高特异(引物特异性决定扩增片段特异性)③适用于降解DNA检材(2kb以下) ④种属特异性好(引物设计只能与人基因组发生退火)⑤复合PCR ：用多对引物同时扩增数条DNA片段→常用于STR基因座检测
• DNA电泳
  • 基本概念原理
    • 混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子量的不同→泳动的方向和速率不同→一定时间内各组分移动的距离也不同→各组分分离
  • 电泳技术的种类
    • 自由界面电泳(无支持介质的溶液中)
    • 区带电泳(有支持介质)
      • 醋酸纤维薄膜电泳；薄层电泳；凝胶区带电泳
  • DNA电泳技术
    • 原理
      • DNA分子是两性电解质→pH值为3.5时带正电向负极泳动，pH为8.0～8.3带负电向正极移动
    • 琼脂糖凝胶电泳
      • ①DNA的分子大小(小的快) ②DNA分子的构象(超＞线＞开环) ③琼脂糖浓度(高慢低快) ④电源电压(低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比) ⑤电泳温度影响不明显 ⑥嵌入染料(线状迁移率降低15%) ⑦离子强度(无离子不移动，高离子凝胶融化)
    • 聚丙烯酰胺凝胶电泳
      • 适合分离1kb以下的DNA片段，分辨率可达 1 bp
    • 毛细管电泳
      • 分辨率可高达1 bp；更有利于进行复合扩增产物的检测
  • 电泳的影响因素
    • 1.待分离生物大分子的性质
      • 电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快
    • 2.缓冲液的性质
      • pH值(接近等电点)，离子强度，缓冲液的粘度
    • 3.电场强度
      • 电场强度越大，电泳速度越快；增大电场强度会使电泳过程产生的热量增大
    • 4.支持介质
      • 在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢