动物细胞培养技术

动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织，用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。

动物细胞培养技术

• 任务一 ★单克隆抗体是由一种B细胞克隆所产生的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。 因此单克隆抗体性质纯、效价高、特异性强，可以避免交叉反应， 提高了抗原抗体反应的敏感性和特异性。 ★基本原理 分泌抗体但体外存活时间短的B淋巴细胞和不分泌抗体但无限增殖的骨髓瘤细胞融合 成能分泌抗体且无限增殖的杂交瘤细胞，经细胞培养，取单克隆抗体。 ★主要过程 动物免疫，脾细胞、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备，细胞融合和杂交瘤细胞的筛选， 阳性杂交瘤细胞的筛选，阳性杂交瘤细胞的克隆及其检测，杂交瘤细胞株的冻存和 单克隆抗体的大量制备。 ★动物免疫 目的:是使B淋巴细胞在抗原刺激下分化、增殖，有利于细胞融合形成杂交瘤细胞， 并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的频率。 动物选择: -同一品系（常用来自Balb/c） -健康小鼠，鼠龄以8～12周为宜，雌雄不限，雌性为佳。 免疫方案:动物免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 -细胞抗原，可取1×10⁷个细胞做腹腔免疫。 -电泳纯化的抗原，可将含有抗原的电泳条带切下，研磨后直接用于动物免疫。 -可溶性抗原，免疫原性弱，一般要加佐剂（常用佐剂:福氏佐剂）， 第一次加完全佐剂（石蜡油+羊毛脂+分支杆菌），以后用不完全佐剂（石蜡油+羊毛脂）。
• 任务二 ★用于单克隆抗体生产的骨髓瘤细胞有何特殊要求？ 用于单克隆抗体生产的骨髓瘤细胞株是由降植烷等油类制剂反复注入小鼠腹腔诱发所产生的,并经毒性药物8一氮鸟嘌吟(8-AG)选育出的HGPT-(缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)骨髓瘤细胞或经5—溴脱氧尿嘧啶选育出的TK-(缺乏胸腺嘧啶激酶)骨髓瘤细胞。 ★为什么要将融合后细胞加在含有饲养细胞的96孔板上？ 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其他活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞。 在细胞融合、杂交瘤细胞筛选及克隆和扩大培养等过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这些过程中均需加入饲养细胞。 ★PEG的分子量和浓度对融合效果及融合率有何影响？ 分子量为1000~6000的PEG均可使用,分子量愈大,毒性愈强,但分子量过小,又影响融合效果。 PEG的工作浓度范围为30%~50%,低于30%融合率低,高于50%时有毒性。 ★HAT培养基筛选杂交瘤细胞的机理是什么？ 细胞是HGPRT酶细胞性细胞，自身不能通过补救合成途任合成DNA和繁殖。B细胞含有HGPRT,但在体外培养只存活 5～7天。 融合细胞（杂交瘤细胞）含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞能利用B细胞的HGPRT酶通过补救合成途径合成DNA繁殖。 因此在HAT培筹基中，HGPRT⁻或TK⁻瘤细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有融合成功的杂交瘤细胞存活。
• 任务三 ★为什么要筛选阳性杂交瘤细胞系？一般使用哪种方法？ 因为它能使得到分泌针对免疫原的特异性抗体。一般常常使用酶联免疫吸附法和双向扩散法。 ★ELISA间接法的基本原理是什么？包括哪些基本操作步骤？ 基本原理是利用酶标记的抗抗体来检测已与固相结合的受检抗体。 基本操作步骤: 收集培养液(待检测抗体)+预先包埋好的抗原→抗原–抗体复合物（洗涤）→加二抗(酶标记的抗抗体) →抗原–抗体–抗抗体–酶复合物→（洗涤）加底物→(颜色反应)抗原–抗体–抗抗体–酶–底物复合物。 ★抗体检测方法除了ELISA法，还有哪些方法？简述其双向扩散法工作原理。 双向扩散法:可溶性抗原与相应抗体在琼脂凝胶为介质中相互扩散,在比例适当处形成抗原–抗体复合物,在凝胶中 出现可见的沉淀线、沉淀孤或沉淀峰。根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡,可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在及含量。 间接免疫荧光法 放射免疫法
• 任务四 ★为什么要对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养？ -因为阳性孔内不能保证只有一个克隆。在实际工作中,可能会出现数个甚至更多的克隆。需要将这些细胞分开,就需克隆化。 -非抗体分泌细胞生长速度比抗体分泌细胞的速度快,二者竞争会使分泌抗体的细胞丢失。 -为防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。 ★有限稀释法成功的关键是什么？ 成功的关键是细胞计数的准确与无菌操作。 ★有限稀释法操作中，为什么有的孔中有两个以上克隆生长？ 因为细胞悬液并不一定均一。 ★除了有限稀释法，还有哪些克隆化培养方法？各有何优缺点？ -软琼脂平板法: 优:细胞不相混、不移动,可待单个细胞 形成集落后,再加以分离培养。 缺:琼脂融化温动难掌握,过高导致细胞死亡，过低细胞分币不均匀，操作复杂，克隆出现率不稳定。 -显微镜操作法: 优:准确性好。 缺:操作复杂、效率低,不常用。 -荧光激活分离法: 优:准确性好,操作较为简单。 缺:不易清洗,使用设备较多。
• 任务
  • 1.人血白蛋白免疫小鼠的准备
  • 2.骨髓瘤细胞和脾细胞的融合
  • 3.抗人血白蛋白杂交瘤细胞的筛选
  • 4.抗人血白蛋白杂交瘤细胞的克隆培养
  • 内容:各个知识点
• 工作方法
  • 细胞培养是一项程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作，工作时必须注意以下几点。 ①将所有的操作程序如洗刷、配液、消毒等制定出统一的规范和要求，并在一定时间内保持相对稳定，同时要求人人遵守。 ②各种用液（培养液、胰蛋白酶、Hank's液、NaHCO3、抗生素液），均应由专人负责配制，并保证做到制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要贴有标签，注上名称、浓度、消毒与否、制备日期及使用人。 ③一切培养用品都要有固定的存放地点，其中尤为重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开；已消毒与未消毒品应严格分开存放。 一切措施都是为了避免各种杂质混入细胞生存环境，防止微生物感染和细胞“污染”。 所谓细胞污染，即细胞间的交叉污染，是指不同的细胞之间因操作不严造成的相互混杂，使细胞群体不纯的现象，近年来世界上不少实验室都出现过这种事故，应引起注意。
• 基本要求
  • 1.培养前准备
  • 2.操作室内消毒
    • 无菌室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30～50mim。 超净工作台台面用紫外线消毒至少30min，然后启动超净台风机和照明灯，再用75%酒精擦拭台面 即可开始实验操作。
  • 3.洗手和着装
  • 4.火焰消毒
    • 无菌操作需在酒精灯火焰周围4-5cm区域内操作。 注:金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才能夹取组织，以免造成组织损伤。 吸管使用前其使用端要经火焰消毒，吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中的 营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液。
  • 5.实验中的操作要求
    • a.动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。
    • b.不能用手触及已消毒器皿，如已解触，应先用酒精棉擦拭再用火焰烧灼消毒或取备用品更换。
    • c.工作台面上的用品要有合理的布局。
    • d.工作由始至终要保持一定的顺序性，组织或细胞在未作处理之前，勿过早暴露在空气中。
    • e.培养液在未用前，不要过早开瓶。打开的瓶口要顺风斜放在支架上或远处。
    • f.吸取营养液、PBS、细胞悬液及其他各种用液时，均应分别使用不同吸管。
    • g.不能面向操作方向讲话或咳嗽。
    • h.手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方。
    • i.加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。
• 应用
  • 生物学研究
  • 临床医学
  • 动物育种
  • 生物制品生产
    • VERO细胞的传代培养
      • 重要名解、知识点
        • ★细胞系指经传一代后可连续传代的细胞。 ★细胞的生长方式有贴壁生长和悬浮生长两种。 而形态特征多以成纤维细胞型和上皮细胞型为常见。 培养细胞的生命期可分为原代培养期、传代培养期、衰退期三个阶段。 ★细胞的常规观察主要是检查培养液的变化、细胞生长情况、细胞形态及有无微生物污染等。 ★原代培养是从幼体或胚胎取组织细胞进行培养，而长至培养瓶80%时分离稀释传到新培养瓶的过程称为传代。 ★冻存和复苏讲究慢冻快融。 ★细胞活性检查是评定细胞冷冻效果的方法之一。有染色法和比色法。 ★染色法:常用染料有台盼蓝、苯胺黑、结晶紫。 ★细胞计数有人工的、自动的。 人工的需使用血细胞计数板。 自动的需使用自动细胞计数仪。
      • 任务
        • 培养前准备、传代和观察、冻存和复苏。
          • 动物细胞体外培养的准备工作主要的目的是为细胞生长提供一个无菌的、营养丰富的生存环境。 VERO细胞有常规观察和生长曲线的测定。 VERO细胞的冻存和复苏（讲究的是慢冻快融，为的是减小冰晶的形成，对细胞有所损伤。 它的冻存需冷冻保护剂,多为使用浓度为10%的二甲基亚砜。
      • 基本过程
        • 需在4度冰箱30min、-20度冰箱1.5h、-70度冰箱过夜,最后投入-196度液氮罐。 它的复苏需在1min内水浴解冻,离心后，弃上清液,移入新环境,次日可换液，弃去死亡细胞后,可继续培养。
      • 定义
        • VERO细胞是非洲绿猴肾细胞，该细胞是经认可的生产疫苗的细胞系。
    • 鸡胚成纤维细胞的原代培养
      • 概述
        • 鸡胚成纤维细胞简称CEF，是一种比较容易培养的细胞，与其他细胞。 CEF细胞的原代培养在许多领域，已发展成为一门重要的生物技术， 并取得了显著成就。
      • 任务
        • 组织块法培养鸡胚成纤维细胞
          • 取材
            • 基本要求
              • 无菌、快、轻、精、丰富、容易、留样
            • 可取的不同组织细胞
              • 皮肤和黏膜
              • 内脏和实体瘤
              • 血细胞
              • 鼠胚组织
              • 鸡胚组织
              • 注意事项（一一对应）
                • 严格消毒（碘酒消毒NO!)
                • 实体瘤可能被细菌污染。
                • 抗凝剂宜量最小量， 量过大易致溶血。
                • 小鼠毛微生物多且不易消毒， 所以取材前，浸入75%酒精 （时间不能太长） 消毒后宜无菌操作。
                • 一切操作都在无菌条件下进行。
          • 知识点
            • 定义
              • 组织块培养是将组织剪切成小块，接种于培养瓶进行的培养。
            • 要点
              • 将组织块剪切成1立方毫米，每小块间距0.5cm左右，块量不要太多， 培养瓶要慢慢翻转平放，让液体缓缓覆盖组织小块，动作要轻巧。
            • 注意事项
              • 1.轻拿轻放 2.防污染 3.照相记录 4.及时换液
        • 消化法培养鸡胚成纤维细胞
          • 方法
            • 机械
            • 化学
              • 胰蛋白酶消化法 有时，为提高消化效果，还常将胰蛋白酶和EDTA按不同比例混合使用。 常用0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶1:1混合或2份EDTA加1份胰蛋白酶。
          • 定义
            • 消化培养法是采用组织消化分离法将细胞间质包括基质、纤维等妨碍细胞生长的物质去除， 使细胞分散，形成悬液进行培养的方法。
          • 要点
            • 已过滤的消化液需在800～1000r/min低速离心5min。
    • CHO细胞的大规模培养
      • 知识点
        • 培养方法有悬浮培养、贴壁培养与固定化培养。 1.悬浮培养值得一提的是贴壁细胞微载体悬浮培养。它，微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术。 核心技术是筛选后使贴壁生长的细胞株适应无血清、无蛋白的培养基环境。采用倍比方式，逐步减少其血清含量，再逐个去除蛋白成分的方法。 称为细胞的筛选驯化，过程中应及时对其进行保藏。 在大规模培养技术中，维持细胞的高质量是非常重要的。于是出现了个性化细胞培养基。 经过天然培养基、合成培养基，发展到无血清培养基、无蛋白培养基、限定化学成分培养基，近百年的发展，已发生质的飞跃。
        • 2.贴壁培养 ★转瓶培养，一般用于过渡培养，它的结构简单。 ★微载体培养，微载体是直径在60-250μm的微珠，表面有少量正电荷。 ★中空纤维培养，是为细胞提供了三维生长基质和生存空间，形成类似活体组织的多层细胞培养物。 ★细胞工厂培养，它特别适合贴壁细胞的生长培养，但不好取出。
        • 动物细胞培养反应器主要分为机械搅拌式、气升式和中空纤维生物反应器。它们各有优缺点。
        • 3.固定化培养 ★吸附培养 微载体和中空纤维培养是其特例。 ★包埋培养 适用于非贴壁依赖细胞，多孔凝胶是其常用的载体。 其中，还有种微囊化培养。
      • 发展
        • 操作方法，随着发展，最早是分批式培养，再是流加、半连续、连续、灌流式培养。 当前生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞进行生产。 当然，可按照其本身需求选择。
      • 前情提要及主要概念
        • ★运用大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。 而中国仓鼠细胞是目前包括工程抗体和重组蛋白在内的生物技术药物生产的最为重要的表达系统。 ★人工控制营养、PH、温度、溶氧和搅拌速度至最佳，使生物反应器中的动物细胞达到能够高密度、大量生产生物制品的技术。
      • 一般工艺流程
        • 首先，获取组织块，剪切至碎片，消化分离后离心，进行原代后传代培养。其将达到最佳状态的细胞进行冻存，后复苏。最后，进行扩大培养和大规模培养制成生物制品。
      • 主要产品
        • 1.疫苗 2.多肽和蛋白质类药物 3.免疫调节剂及单克隆抗体。
      • 任务
        • CHO细胞的发酵罐培养。
    • 抗人血白蛋白杂交瘤细胞系的制备
      • 背景
        • 可开发一种操作简单、判读方便、结果准确的尿白蛋白检测方法 过程中一种重要的原料。
• 发展点
  • 创立
    • 现在一般认为细胞培养技术是从 R.Harrison和A.Carrel两人真正开始的。
      • 1907年，Harrison的实验开创了动物组织和细胞培养的先河， 标志着盖玻片悬滴培养法的建立。
      • Carrel把外科手术的无菌操作观念带到了组织培养实验中，在进行实验时特别注意无菌操作。 Carrel的第二个重要贡献是将培养组织包埋技术、营养供应以及传代培养等许多重要的培养条件和 方法引入组织培养过程中，从而使多种动物组织培养获得成功。 1923年，Carrel又设计了用卡式瓶培养的方法，以扩大组织的生存空间，为组织细胞培养的发展奠定了基础。
  • 发展
    • 培养器材
    • 培养方法
      • 发展过程中 具有历史意义
        • 盖玻片悬滴培养法、 旋转管培养法、 灌流小室培养法和 目前普遍应用的单层细胞培养法。
    • 培养液
      • 天然培养基（胎汁、血浆、血清）
        • 合成培养基（胎牛血清10%）
          • 无血清培养基
            • 无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞的毒性作用，使产品易于纯化、回收率高；其成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；还可根据不同的细胞株设计和优化适合其高密度生长或高水平表达的培养基。 从对人类和动物安全性的长远考虑，生物制品生产越来越倾向采用无血清无动物组分培养基，国际上生物制药生产中，已经有50%以上采用无血清细胞培养基。
• 优缺点
  • 优点
    • 简化环境，方便控制因素、易观测结果、 均一性、降成本、利于大规模生产。
  • 缺点
    • 对营养要求高、生长慢、对环境要求高、 与体内细胞存在差异、不稳定性。
• 概念
  • 动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织，用机械或消化的方法分散成单细胞悬液,然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。