紫外-可见分光光度法

可见分光光度仪采用经典的光路系统和精良的制造工艺，使仪器的测试精度及稳定性较传统产品有很大的提高；可见分光光度仪已经成为现代分子生物实验室常规仪器。仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成

紫外-可见分光光度法

• 基本原理
  • 紫外-可见吸收光谱
    • σ→σ*跃迁
    • π→π*跃迁
    • n→π*跃迁
    • n→σ*跃迁
    • 电荷迁移跃迁
    • 配位场跃迁
  • 紫外-可见吸收光谱的有关概念
    • 吸收光谱特征
      • 吸收峰→最大吸收波长、波谷→最小吸收波长、肩峰、末端吸收
    • 生色团：有机化合物分子结构中含有 π→π*跃迁或n→π*跃迁的基团
    • 助色团：含有非键电子的杂原子饱和基团，本身不吸收波长大于200nm的光，但与生色团或烃相连能使其吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加
    • 红移和蓝移：向长波方向移动称红移（长移），向短波方向移动称蓝移（短移)
    • 增色效应和减色效应：使吸收带的强度增加或减弱的现象称为增色效应或减色效应
    • 强吸收带和弱吸收带：摩尔吸光系数εmax大于10的4次方的吸收带称强带，小于10的2次方的吸收带称弱带
  • 吸收带及其与分子结构的关系
    • R吸收带：由n→π*跃迁产生的吸收带，处于较长波长范围（250nm-500nm)，弱吸收，ε＜100.溶剂极性增加，R带发生短移。
    • K吸收带：共轭双键中π→π*跃迁产生的吸收带，吸收峰217nm-280nm，ε＞10的4次方。溶剂极性增加→红移
    • B吸收带：芳香族化合物的特征谱带，230-270nm,中心256nm左右，ε约为220，通常出现若干小峰或称精细结构，但苯环上有取代基且与苯环共轭或在极性溶剂中测定时精细结构会简单化或消失。
    • E吸收带：是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的π→π*跃迁所产生的，也是芳香化合物的特征吸收。
      • E₁带：吸收峰约在180nm,ε为4.7×10的4次方，强吸收带、 E₂带：吸收峰约在200nm，ε约为7×10³，强吸收带
  • 某些常见有机化合物的吸收光谱
    • 饱和烃及其取代衍生物
    • 不饱和烃及其共轭烯烃
    • 羰基化合物
    • 苯及其取代衍生物
      • 苯和取代苯、稠环芳烃及杂环化合物
  • 影响紫外吸收光谱的主要因素
    • 共轭效应
    • 立体效应
      • 位阻影响、跨环效应
    • 溶剂效应
    • 体系pH的影响
• Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
  • A（吸光度)=KCl（K吸光系数，与测定波长有关，一定条件下是常数）
    • 摩尔吸光系数ε
    • 百分吸光系数（比吸光系数）E¹₁%cm
    • ε=(M/10)×E¹₁％㎝
  • 吸光度的加合性
  • 偏离Beer定律的因素
    • 与样品溶液有关的因素
      • 溶液浓度小于0.01mol/L的稀溶液
      • 溶液浓度增大可能会发生缔合、离解、光化学反应、互变异构及配合物配位数的变化等
      • 溶剂及介质条件（如PH）
      • 当测定溶液有胶体、乳状液或悬浮物质存在时
    • 与测量仪器有关的因素
      • 非单色光
      • 杂散光
      • 散射光和反射光
      • 非平行光
  • 测量条件的选择
    • 检测波长的选择（最大吸收原则）
    • 适宜吸光度范围的选择（0.3-0.7）
    • 仪器狭缝宽度的选择
• 显色反应及其显色条件选择
  • 参比溶液的选择
    • 纯溶剂、试剂空白、试样空白
• 紫外-可见分光光度计
  • 主要部件
    • 光源
      • 辐射强度大、稳定性好、使用寿命长（ 卤钨灯、氘灯）
    • 单色器（棱镜和光栅）
    • 吸收池（熔融石英）
    • 检测器
      • 光电池
      • 光电管
      • 光电倍增管
      • 光二极管阵列检测器
    • 信号处理和显示系统
  • 类型及校正和检查
    • 分光光度计类型
      • 单光束分光光度计
      • 双光束分光光度计
      • 双波长分光光度计
      • 光学多通道分光光度计
      • 光纤探头式分光光度计
    • 分光光度计的校正和检查
      • 波长的校正
      • 吸光度的校正
• 定性与定量分析
  • 定性分析
    • 对比吸收光谱特征数据（λmax）
    • 对比吸光度（或吸光系数）的比值
    • 对比吸收光谱的一致性
  • 纯度检查
    • 杂质检查、杂质的限量测定
  • 单组分定量分析方法
    • 吸光系数法
    • 工作曲线法
    • 对照法
  • 多组分定量分析方法
    • 线性方程组法
      • 吸收光谱不重叠
      • 吸收光谱部分重叠
      • 吸收光谱双向重叠
    • 双波长法
    • 导数光谱法
• 紫外光波长10-400nm,远紫外光10-200nm，近紫外光200-400nm。通常所说的紫外-可见光谱，实际上指近紫外-可见光谱（200-800nm）。