生化分离与分析技术

内容并不全面，仅为老师所画重点。等电聚焦：EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可 形成连续的稳定的线性的pH；当蛋白质在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为 零，不再移动。

生化分离与分析技术

• 生物技术分为上下游过程
  • 上游过程
    • 目的在于制造出药物，属于生物加工过程，如酶工程、基因工程技术、细胞培养工程、发酵工程等。
  • 下游过程
    • 目的在于纯化出药物，属于生物分离过程，包括药物的提取、分离、精制工艺，药物产品的检测及质量保证等。
• 第一章 绪论
  • 第一节 生化分离纯化的概念与原理
    • 生化物质分离
      • 从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。
    • 生物产品要求
      • 高纯度、卫生、生物活性
    • 其他
      • 下游过程的成本占产品总投资的大部分，因此必须仔细考虑和设计产品的回收和纯化过程。
  • 第二节 分离纯化策略
    • 一、生物分离纯化技术的特点
      • 环境复杂、分离纯化困难
      • 含量低、工艺复杂
      • 稳定性差、操纵要求严格
      • 目标产物最终的质量要求很高
      • 终极产品纯度的均一性与化学分离上纯度的概念并不完全相同
    • 二、发酵液处理
      • 发酵液预处理和菌体回收
      • 预处理
        • 目的
          • 促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率
            • （1）改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体粘度
            • （2）相对纯化，去处发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作
            • （3）尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）
        • 方法
          • （1）凝聚和絮凝
            • 凝聚
              • 凝聚剂常是小分子物质，在其作用下，胶体脱稳并相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程
              • 机理：凝聚剂有些是对表面电荷的简单中和，有些是消除双电荷层而脱稳，有些是通过氢键或其他复杂形式与离子结合而产生凝聚
            • 絮凝
              • 指使用絮凝剂（天然或合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。 如：聚丙烯酰胺类絮凝剂
          • （2)加热法
            • 加热是发酵液预处理最简单和廉价的方法，即把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。
              • 1.加热降低液体粘度：液体黏度是温度的指数函数，升温是降低液体粘度的有效措施。
              • 2.加热使蛋白质变性凝固：变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至80℃以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。
            • 加热处理适用于对热较稳定的物质。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。
          • （3）调节pH
            • 细胞碎片及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
            • 调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是去除蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。
            • 通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染。
          • （4）加入惰性助滤剂
            • 助滤剂是颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质。助滤剂有许多滤孔不会全部被堵塞，可以保持良好渗透性。
            • 使用方法：在滤布上直接涂抹助滤剂，加入悬浮液过滤。
• 第二章 发酵液的固液分离
  • 常见的固液分离方法
    • 过滤
      • 错流过滤
        • 又称切向流过滤：液体的流向和滤膜相切
        • 在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的的内壁做切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度
    • 离心
      • 离心分离
        • 固体颗粒细小难以过滤时，离心操作十分有效
        • 在离心场中使用不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程
        • 动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离
    • 膜分离
    • 双水相萃取
    • 扩张床吸附
• 沉淀法
  • 蛋白质的沉淀
    • 蛋白质从胶体溶液中析出
      • 一、可逆沉淀
        • 温和条件，改变溶液pH或蛋白质所带电荷
        • 蛋白质结构和性质没有变化
        • 适当条件下可重新溶解
        • 非变性沉淀
        • 等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等
      • 二、不可逆沉淀
        • 强烈沉淀条件
        • 破坏蛋白质胶体溶液稳定性
        • 破坏蛋白质结构和性质
        • 沉淀不能再重新溶解
        • 变性沉淀
        • 加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等
• 电泳分离
  • 一、定义
    • 带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极运动的过程
  • 二、等电聚焦
    • EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成连续的稳定的线性的pH
    • 当蛋白质在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动
  • 三、SDS-PAGE测定蛋白质分子量
    • 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于他的分子量，与所带电荷和形状无关
  • 四、双向凝胶电泳
  • 五、高效毛细管电泳
    • 毛细管壁以玻璃和硅酸为主要成分
    • 电渗：电场高压下，双电层水合阳离子引起流体整体向负极移动
    • 微粒在毛细血管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和
• 酶的分离纯化
  • 一、目标
    • 使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度
  • 二、酶制剂工业提取的原则
    • 防止酶变性失活（首要原则）
    • 使用最少的纯化步骤
    • 选择有效的提取方式
    • 提取的每一过程测定酶活性
• 目标物质的分析检测与鉴定
  • 一、生物物质的分析与鉴定
    • 检测蛋白质W
      • 电泳
      • 转膜
      • 封闭
      • 一抗处理NC膜
      • 二抗处理
    • 检测DNA N
      • 限制性内切酶消化DNA成片段，电泳分离，将胶上的DNA变性，将单链DNA片段转移至膜上，与相对应结构的标记探针进行杂交，检测特定DNA
    • 检测RNA S
      • 同上
    • 紫外或荧光检测
    • 特殊的化学反应
    • 薄层层析TLC
    • 高效液相HPLC
    • 高效液相-质谱联用LC-MS
      • • （1）使用标准曲线法
          • 用分析的纯标准做标准曲线
          • 测量样本
          • 用标准曲线比较样品的色谱峰
        • （2）使用单点校正法
          • 在样品提取物中预期浓度的20%范围内
        • 经常使用，需要良好的回收率
    • 用内标法定量
      • 加样回收率不好时用
      • 优点：定量准确，误差可被内标补偿
      • 要点：在标准液和提取前的样品中加同量的内标
      • 响应因子：被测物和内标的峰面积比
      • 标准曲线法的Y-X轴
        • Y响应因子
        • X浓度
• 沉淀结晶及成品干燥
  • 一、常用的结晶方法
    • • 盐析结晶法：加盐降低溶剂度
      • 有机溶剂结晶法：加有机溶剂，含盐少，时间短，但要注意防止变性
      • 透析平衡结晶法
      • 等电点结晶法：调节pH达到pI，防止局部过酸或碱，常配合透析平衡和扩散法
      • 温度差结晶
      • 金属离子复合结晶法
  • 二、酶结晶的原理
• 第三章 细胞破碎与分离
  • 一、细胞壁的组成和结构
  • 二、细胞破碎方法及其原理
    • 机械破碎
      • 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。
        • 捣碎法
        • 研磨法
        • 匀浆法
        • 超声法
    • 物理破碎
      • 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎
        • 温度差破碎法
        • 压力差破碎法
    • 化学破碎
      • 通过化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎
        • 有机溶剂
        • 表面活性剂
        • 酸碱
    • 酶促破碎
      • 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎
        • 自溶法
        • 外加酶制剂法
  • 三、机械法和非机械法
    • 机械法
      • 机械法方法
        • 高速搅拌珠研磨破碎法
          • 将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌。
        • 高压匀浆破碎法
          • 由高压泵和匀浆阀组成，细胞在一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤减，造成细胞破碎。
        • 超声波破碎法
          • 大量声能被转化成弹性波形式的机械能
      • 机械法缺点
        • 需要高的能量并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定产品变性失活。
        • 产物非专一，产生微粒尺寸范围大，分离困难。
    • 非机械法
      • 酶溶破碎法
        • 酶解法概述
          • 专一性强
          • 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
          • 溶菌酶适用于革兰氏阳性菌的细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。
          • 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。
        • 酶解法的优点
          • 能选择性的释放产物
          • 抽提的速率和收效高
          • 发生酶解的条件温和
          • 不残留细胞碎片
          • 但酶水解价格高，故小规模应用较广
      • 化学破碎法
        • 酸碱处理
          • 改变蛋白质所带电荷，物质间作用力降低，蛋白质溶解。
        • 有机溶剂
          • 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯。
        • 表面活性剂
          • SDS（十二烷基磺酸钠）、Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）和吐温（Tween-80）等。
          • 两性化合物，在水中形成胶团，将蛋白质包在胶团内，而蛋白质的亲水基向水相，改变其通透性。
        • 化学法优缺点
          • 化学法和酶法一样对产物的释放有选择性，细胞外形比较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后续分离，故使用较多。
          • 化学法容易引起物质失活，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。
          • 化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物的纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。
      • 渗透压冲击破碎法
        • 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。
        • 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
      • 冻融破碎法
        • 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
        • 1）能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；2）胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。
        • 适用于细胞壁较脆弱的菌体
      • 干燥破碎法
• 膜分离过程
  • 一、微滤、超滤、纳滤、反渗透
  • 二、电渗析
  • 三、透析原理图
  • 四、截断曲线
    • • 质量好的膜，截断曲线陡直，可是不同分子量的溶质分离完全；斜坦的截断曲线会导致分离不完全。
  • 五、亲和膜分离技术要点
    • （1）找到与底物专一可逆结合的配基
    • （2）将配基通过共价键偶联到配基
    • （3）配基与底物吸附
    • （4）洗脱目标物
  • 六、渗透蒸发膜技术概述
    • 1、本质原因
      • 料液中各组分在膜中的溶解度和扩散速度存在差异
    • 2、分离推动力
      • 组分在膜两侧的蒸汽分压差。分压差越大，推动力越大。尽可能提高两侧蒸汽分压差。
    • 3、实现方法
      • 提高膜上游侧蒸汽分压，降低膜下游侧蒸汽分压
    • 4、渗透蒸发膜材料
      • 优先透水膜
        • 膜结构中含有亲水性基团，可与水分子发生相互作用
          • 聚乙烯醇膜（PVA）
          • 壳聚糖膜
          • 聚丙烯酸类膜
      • 优先透有机膜
        • 通常选用极性低、表面能小和溶解度参数小的聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、有机硅聚合物、含氟聚合物等。
  • 七、溶剂萃取
    • 有机溶剂萃取（简称溶剂萃取）
    • 液固萃取或浸取
    • 超临界流体萃取
      • 将超临界流体作为萃取溶剂的一种萃取技术，它兼有传统的蒸馏和液液萃取的特征，是适用面很广的一项新型分离技术
      • 超临界流体（SCF)的特性
        • 兼有液气双重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。密度比气体大和液体相近，溶解度高。
      • CO2的P-T-ρ图
        • 特点：在临界点附近，密度变化很大；温度压力微调可使密度显著变化
      • 基本操作
    • 反胶团萃取
      • 表面活性剂是构成反胶团的必要条件
      • 亲和反胶团萃取
        • 定义：在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂。
        • 通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配
    • 双水相萃取
      • 双水相系统
        • 是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相容的两水相或多水相系统
      • 其他
        • 高聚物与高聚物形成两相是因为高聚物之间的不相容性
        • 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这是由于盐析作用
        • 生化工程中，多应用聚乙二醇-葡聚糖和聚乙二醇-无机盐系统
    • 液膜分离法
      • 又称液膜萃取法
        • 以液膜为分离介质，以浓度差为推动力的膜分离操作
      • 液膜
        • 定义：液膜是悬浮在液体中很薄的一层乳液微粒。它能把两个组成不同而又互溶的溶液分开，并通过渗透现象起到分离的作用
        • 组成：溶剂（水和有机溶剂）、表面活性剂和添加剂。
          • 溶剂——膜基体
          • 表面活性剂——乳化作用
          • 添加剂——控制膜的稳定性和渗透性
        • 液膜类型
          • 乳状液膜
            • 根据成膜液体的不同分为水油水和油水油，生物分离中主要应用水油水wow
          • 支撑液膜
            • 由于将液膜含浸在多孔支撑体上，可以承受较大的压力，且具有更高的选择性，因而它可以承担合成聚合物膜所不能胜任的分离要求
              • 比乳状液膜操作简便，更适合工业
      • 膜相载体运输
        • 利用载体输送的萃取过程可大大提高溶质的渗透性和选择性。载体输送有能量泵的作用。
    • 反胶束萃取
      • 反胶束
        • 表面活性剂（亲水、亲油基）分散于有机相中自发形成纳米尺度的一种聚集体
        • 反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统
      • 反胶束形成过程
      • 反胶束萃取蛋白质