第三章：细胞生物学研究方法

用标记的核苷酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。利用核素的电离辐射使含溴化银或氯化银的乳胶感光的作用，对细胞内生物大分子进行定位，定性与半定量研究，对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究

细胞生物学研究方法

• 细胞形态结构的观察方法
  • 光学显微镜技术
    • 普通复式光学显微镜技术
      • 组成
        • 光学放大系统
        • 机械和支架系统
        • 照明系统
      • 分辨率
        • 定义：区分两个质点间的最小距离
        • 光学显微镜：0.2um，人眼分辨率：0.2mm，电子显微镜：0.2nm。激光扫描共焦显微镜分辨率比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4-1.7倍
    • 相差和微分干涉显微镜技术
      • 相差显微镜
        • 将相位差转变为振幅差
      • 微分干涉显微镜
        • 以平面偏振光为光源
    • 荧光显微镜技术
      • 用荧光素标记生物大分子，从而进行定性或定位研究
    • 激光扫描共焦显微镜技术
      • 一小束光点照射，物镜和聚光镜共聚焦，小孔挡住其他层面的成像
    • 荧光共振能量转移技术
      • 荧光转移
    • 荧光漂白恢复技术
      • 利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光发生不可逆的淬灭。
  • 电子显微镜技术
    • 分类：透射电镜和扫描电镜。对样品的要求：薄，精细结构
    • 电子显微镜的基本知识
      • 电子显微镜与光学显微镜的基本区别
      • 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数
      • 电子显微镜的构造
        • 电子术照明系统
        • 成像系统
        • 真空系统
        • 记录系统
    • 主要电镜制样技术介绍
      • 超薄切片技术
        • 固定
          • 锇酸和戊二醛
        • 脱水
        • 包埋
          • 环氧树脂
        • 切片
        • 染色
      • 负染色技术
        • 用重金属盐对电镜样品进行染色的技术，使得重金属盐沉积在样品周围，而样品不被染色，从而存托出样品的精细结构
      • 冷冻蚀刻电镜技术
        • 样品经冷冻断裂后，在真空中短暂暴露，使断裂面上的一层薄冰升华，暴露出蚀刻面，以便在电子显微镜下观察
      • 电镜三维重构技术
        • 对样品在电镜中的不同倾角下进行拍照，经过处理，最终展现出生物大分子及其复合物的三维结构的电子密度图。
      • 扫描电镜技术
        • 利用电子在样品表面扫描产生二次成像的显微镜
  • 扫描隧道显微镜
• 细胞组分的分析方法
  • 超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
    • 差速离心
      • 利用不同离心速度所产生的不同离心力，将亚细胞组分和各种颗粒分开
    • 密度梯度离心
      • 利用各组分在介质中的沉降系数不同，使各组分形成区带
        • 速度沉降
          • 分离密度相近而大小不一的细胞组分
        • 等密度沉降
          • 分离不同密度的组分
  • 细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法
    • 富尔根反应-DNA
    • PAS反应-多糖
    • 四氧化锇-不饱和酸-黑色
    • 苏丹三-脂滴-深红色
  • 特异蛋白抗原的定位与定性
    • 免疫荧光技术
      • 将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法
    • 免疫电镜技术
      • 能更有效的提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位
  • 细胞内特异核苷酸序列的定位与定性
    • 原位杂交
      • 用标记的核苷酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。
  • 放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态
    • 利用核素的电离辐射使含溴化银或氯化银的乳胶感光的作用，对细胞内生物大分子进行定位，定性与半定量研究，对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究
  • 定量细胞化学分析技术
    • 流式细胞仪
      • 可定量的测定某一细胞中的DNA，rna或某一特异的蛋白的含量，以及细胞群中上述成分含量不同的细胞的数量。
        • 原理或过程
          • 细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异的荧光染色，然后使悬液中的细胞一个个的通过流式细胞仪。当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷或不被充电，同时检测器可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量。因带有不同表面标记的细胞所带的电荷不同，当液滴通过高压偏转板时，带不同电荷的液滴发生偏转，从而达到将细胞分选的目的。
    • 显微分光光度测定技术
      • 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定其在细胞内的含量。
• 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
  • 细胞培养
    • 动物细胞培养
      • 原代培养细胞
        • 从机体取出后立即培养的细胞
      • 传代培养细胞
        • 适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞
      • 细胞系
        • 顺利传代40-50代次的细胞，并保持原来染色体的二倍体的数量及接触抑制行为的传代细胞
      • 有限细胞系
        • 传至50代以后不能再传下去的细胞系
      • 永生细胞系
        • 在传代过程中部分细胞发生了遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制的传代培养下去
      • 细胞株
        • 用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增殖形成的，具有基本相同的遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。该细胞群体经过生物学鉴定，如具有特殊的遗传标记或性质，这样的细胞系称为细胞株。
    • 植物细胞培养
      • 单倍体细胞培养
      • 原生质体培养
  • 细胞工程
    • 细胞融合与细胞杂交技术
      • 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合。基因型相同的细胞形成的融合细胞称为同核融合细胞，基因型不同的细胞形成的融合细胞称为异核融合细胞。
    • 单克隆抗体技术
      • 使小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞在聚乙二醇的介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞一方面可以分泌抗绵羊红细胞的抗体，另一方面像肿瘤细胞一样，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而可以大量制备纯一的单克隆抗体。
    • 细胞拆合与显微操作技术
      • 分为物理法和化学法两种类型。物理法就是用机械的方法把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中组成新的杂交细胞。化学法就是用松弛素b处理细胞，细胞出现排核现象，在结合离心技术，将细胞拆分为核体和胞质体两部分。由于核体外表包有一层细胞质膜和少量胞浆，因而在仙台病毒的介导下，核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。
• 用于细胞生物学研究的模式生物
  • 病毒
    • 病毒的结构非常简单，是由蛋白质和核酸组成的复合体，病毒必须进入细胞才能进行自身的复制。由于病毒的基因组很小，故很适合遗传操作，进行有关生物大分子之间的相互作用、基因表达调控、肿瘤的发生和防治等方面的研究
  • 细菌
    • 大肠杆菌作为原核生物的代表已经被广泛应用于分子生物学的研究，大肠杆菌的基因组序列已测定完毕，细菌培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变和分离鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简单。
  • 酵母
    • 具有真核细胞的组织结构，但结构简单，生长迅速并且易于遗传操作，可以用于基因表达调控，细胞分化和衰老
  • 线虫
    • 通体透明，体内每一个细胞都可被追踪，胚胎发育过程中细胞分裂、分化以及细胞的死亡具有高度的程序性，便于对其进行遗传学分析，用于研究生物学，遗传学和基因组学
  • 果蝇
    • 基因组序列测定完成，易于进行遗传学操作，可用于研究基因表达调控，胚胎发育，细胞分化机制等。
  • 斑马鱼
  • 小鼠
    • 进化方面最接近人类，基因组序列测定完成，用于遗传学研究
  • 拟南芥