蛋白质分子基础第二章 蛋白质的制备

蛋白质分子基础第二章 蛋白质的制备思维导图，本图知识梳理清楚，欢迎有需要的同学下载使用。

第二章: 蛋白质的制备

• 第一节 蛋白质分离纯化的一般程序
  • 1.生物组织的机械破碎
    • 研磨法
    • 超声波法
    • 冻融法
    • 酶解法
    • （细胞外分泌物无需破碎）
  • 2.根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提
    • 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，
    • 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，
    • 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提
  • 3.离心
    • 去亚细胞颗粒、细胞碎片
  • 4.粗提
    • 沉淀法、超滤法、萃取法
      • 得到蛋白质粗制品
  • 5.精制
    • 可用层析法、电泳法等进行精制
  • 6.结晶
    • 取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质
• 第二节 蛋白质的粗分离
  • 材料的选择
    • 目的蛋白质的含量要高
    • 容易获得
    • 不同种属和个体会有差别（时空表达）
      • 动物：性别、年龄、季节、生理条件不同，蛋白质在质和量上会有区别
      • 植物：不同组织、器官、不同发育阶段、有外来病理侵袭时各不相同
    • 注意:取材后立即使用或置-20−-80℃保存备用
  • 细胞抽提液的制备
    • 尽量使用类似于生理条件下的缓冲液
      • 20~50 mmol/L的磷酸缓冲液(PBS)，pH7.0~7.5；
      • 0.1 mol/L Tris-HCl ，pH 7.5-8.5；
      • 缓冲液中可加入EDTA（1~5 mmol/L）或者蛋白质稳定剂（DTT，PMSF，protease inhibitor）等。
    • 其他注意事项
      • 动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。
      • 制备植物细胞时，在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变, 它可以吸附多酚化合物。
      • 革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化，37摄氏度处理15分钟即可溶解细胞壁。
      • 革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂（如Triton X-100）、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I（10 ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的质量。
  • 膜蛋白的释放
    • 膜蛋白存在于细胞膜或各种细胞器当中
      • 叶绿体
      • 线粒体
      • 内质网
      • 或细胞核
    • 外周蛋白的分离
      • 外周蛋白
        • 通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。
        • 与膜的内、外表面弱结合的膜蛋白
        • 占膜蛋白的20~30%
      • 改变离子强度/提高温度
      • 利用含金属螯合剂（EDTA）的适当缓冲液可将其抽提出来
    • 膜内在蛋白的提取
      • 内在蛋白（固有/整合蛋白）
        • 嵌合在膜脂双层结构中。
        • 大部分膜蛋白是固有蛋白
      • 原则
        • 抽提膜蛋白时，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合，同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。
      • 常用的增溶剂是去污剂，它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离，同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。
        • 按结构可分为四种
          • 1.阴离子去污剂
            • 脱氧胆酸盐（DOC），SDS
          • 2.阳离子去污剂
            • 溴化十二烷基三甲铵
          • 3.两性离子去污剂
            • 二甲基十二烷基甘氨酸
          • 4.非离子去污剂
            • Triton X-100，Tween
      • 用去污剂增溶之后，膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂，再进行其他方法的分离纯化
    • 其他方法
      • 用脂肪酶A消化脂肪，使膜蛋白释放出来
      • 在高pH值和较高温度下进行超声作用，以释放膜蛋白
      • 在低温(-200C)下，用丙酮处理组织和细菌，抽提出大部分脂肪。再将所得到的丙酮干粉溶在水溶性的缓冲液中，可溶性的蛋白就可以分离出来。再进行进一步的分离纯化。
  • 蛋白质的浓缩和脱盐
    • 脱盐
      • 透析法
        • 用前在含EDTA的溶液中煮——除去核酸酶和蛋白酶
      • 纤维过滤透析法
      • 分子筛层析法
    • 浓缩
      • 沉淀法
        • 用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀，再将沉淀溶于少量溶液中。
      • 吸附到层析柱上，然后用少量盐洗脱
      • 干燥吸附法
        • 用固体吸附剂如Sephadex G25等，冻干法，真空干燥法。
      • 渗透浓缩法
        • 将干粉PEG-20000涂在装有蛋白质溶液的透析袋上，可吸干水分
      • 超滤浓缩法
        • 用超滤膜滤去小分子和水，达到超滤的目的
        • 超过滤法
        • 离心超滤法
          • 选择规则：截留分子量不应大于目的蛋白的1/3
          • 注意
            • 耐受离子情况，低温，低转速和加速度离心,防止局部蛋白浓度过高产生沉淀; 0.2M NaOH重生。
  • 沉淀法分级蛋白质
    • 沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、蛋白质分子生成固体凝聚物析出的现象。
    • 变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性使蛋白质析出。
    • 在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。
    • 蛋白质溶液
      • 水溶性蛋白质分子表面带有亲水基团
        • 能够发生水化作用，可以和水结合，进入水溶液当中。
      • 在溶液的pH值偏离等电点时，蛋白质就会带同样的电荷，导致同性相排斥，使蛋白质分子进一步分散。
      • 等电点时整个蛋白质是中性的，水化作用此时最弱，蛋白质的溶解度值最小。
    • 方法学原理
      • 破坏蛋白质与水分子之间的水化/水合作用
      • 减弱蛋白质分子之间同性相排斥的作用
    • 常用方法
      • 盐析法
        • 保持蛋白质的生理活性
        • 盐溶作用
          • 一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加。
          • 在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。
          • 稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点。（0.15-0.25M/L）
        • 是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质溶解度降低，并且沉淀析出的方法。
        • 在高盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度的关系:
      • 有机溶剂法
        • 在蛋白质溶液中加入有机溶剂，可以使蛋白质沉淀
        • 原理
          • 1.增大带电质点之间的静电引力（F）。
          • 2.破坏蛋白质表面的水合层，使蛋白质分子脱水而沉淀。
      • 有机聚合物沉淀法
      • 选择性变性沉淀法