蛋白质测序

蛋白质测序的一般步骤 （1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）测定多肽链的氨基酸组成。（4）断裂链内二硫键。

蛋白质测序

• 得到均一且纯度很高（≥79%）的待测肽链
  • 多肽链的分离
    • 可以采用尿素或盐酸胍，或高浓度盐处理，使蛋白质的亚基分开。一旦拆分后，可以根据大小或电荷的不同分离各种肽链。
  • 二硫键的断裂
    • 1，过甲酸氧化切割
    • 2，巯基化合物如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)还原切割，随后与碘乙酸反应保护游离的——SH。
  • 氨基酸组成的分析
    • 用 HCI 水解蛋白质，用氮基酸分析仪的离子交换柱分离后用水合药三们法 含量。水解过程中有些氨基酸被破坏，用诚水解或酶水解另行测定。
    • 不能直接得出每种氨基酸残基的数目，但可以得百分含量。
  • N端残基的鉴定
    • 常用2，4-二硝基氟苯（DNFB)反应或丹磺酰氯反应。某些蛋白质的 N 端氫基被封闭，需要用酶肽水解来鉴定
  • C端残基的鉴定
    • 常用羧肽酶法
  • 多肽链的裂解
    • 由于现在测定方法只能测定连续小段的肽段，所以要用两种以上的不同方法在不同位点裂解成两套以上的大小不等的小肽段，分离后分别测序，然后拼接成长肽链。
  • 肽段氨基酸序列的测定
    • ①Edman降解法
    • ②质谱法
    • ③核苷酸序列推定法
  • 肽段的拼接
    • 长肽链需要裂解成大小不等的小肽段，分离后分别测序，然后寻找有部分重叠的肽段进行拼接
  • 二硫键位置的确定
    • • 在不断裂二硫键的情况下，将蛋白质水解成小肽段（常用胃蛋白酶），在一块方形滤纸上先对水解产物进行一次电泳，用过甲酸处理滤纸断裂二硫键后，将滤纸旋转90°，再用与第一次电泳完全相同的条件进行第二次电泳。在过甲酸处理时未发生变化的肽段，在两次电泳中的迁移率相同，将位于滤纸的对角线上。含二硫键的肽段由于二硫键断裂，在两次电泳中的迁移率不同，会偏离对角线。