原生质体培养与诱变

酶解法具有条件温和，原生质体完整性好、活力高、得率高等优点。经常采用的酶包括琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。

原生质体培养与诱变

• 原生质体培养
  • 原生质体（protoplast）是去除细胞壁后裸 露的球形细胞。
    • 特征
      • （1）无细胞壁障碍，能摄取DNA、质粒、病毒、 细菌、细胞器等外源物质，是植物细胞进行遗传操 作、诱变育种的良好材料。
      • （2）对于植物，适合作为材料进行细胞融合形成杂 种细胞，克服不同种细胞间的不亲和障碍，培育新 品种。
      • （3）具有全能性，可再生细胞壁并发育成完整植株。
• 原生质体的分离纯化
  • 原生质体的分离
    • 酶解法具有条件温和，原生质体完整性好、活力高、得率高等优点。 经常采用的酶包括琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。
    • 机械分离法
  • 原生质体的纯化
    • 1）过滤-离心法；
    • 2）漂浮法；
    • 3）过滤- 离心法和漂浮法结合。
• 原生质体培养与植株再生
  • 原生质体的起始密度为104～106/mL，如果采用的是看护培养等特殊方法，密度 可降低。
    • 细胞壁再生、细胞分裂成细胞团、愈伤组织（或胚状体）形成、植株再生过程
• 原生质体的鉴定与活力测定
  • 原生质体的鉴定
    • 1）低渗爆破法
    • 2）荧光染色法
  • 原生质体的活力测定
    • 1）染色法
      • 二乙酸荧光素（FDA）法
      • 酚藏花红染色法：取一滴原生质体悬液置载玻片上，加一滴0.1% 酚 藏花红溶液，具有活性的原生质体均不着色，而死亡的原生质体立即着染 成红色。
      • 伊文思蓝染色法：有活力的原生质体不吸收染料（浓度为0.25%）， 为无色，而没有活力的原生质体吸收染料，显示蓝色。
    • 2）胞质环流法
      • 在显微镜下观察原生质体是否存在胞质环流来判断原生质体的活力。有胞质环 流的原生质体有活力。
    • 3）渗透压法
      • 将原生质体放入渗透压较低的溶液中，其体积会膨胀；放进高渗溶液中，其体 积会缩小，这样的原生质体是有活力的原生质体，而体积不变的是已经死亡的 原生质体。
    • 4）氧电极法
      • 有活力的原生质体在光照下会进行光合作用而放出氧气，在没有光照的条件下 进行呼吸而耗氧。因此，可以采用氧电极测定氧的变化来判定原生质体是否具 有活力
• 原生质体变异
  • 自发变异
  • 诱导变异
    • 物理诱变剂：包括X 射线、γ 射线、β 射线和中子等。按照突变 频率大小，一般顺序为中子＞γ 射线（或X 射线）＞β 射线。近年来， 激光、离子束、电子束、微波等诱变剂也开始在植物原生质体育种中 应用。
    • 化学诱变剂：主要有5-溴（氟）尿嘧啶、2-氨基嘌呤、亚硝基 胍、甲基磺酸乙酯，以及羟胺、亚硝酸等