植物细胞培养

植物细胞培养（plant cell culture）定义是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。是在植物组织培养基础之上发展起来的。

植物细胞培养

• 植物细胞培养技术
  • 植物细胞培养（plant cell culture）定义是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。是在植物组织培养基础之上发展起来的。
  • 特点
    • （1）植物细胞直径一般为10～200μm，平均直径比微生物细胞大30～100 倍。
    • （2）植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。
    • （3）植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。
    • （4）与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长。
    • （5）植物细胞培养基成分丰富而复杂，防止微生物污染更困难。
    • （6）植物细胞培养一般需要光照，氧气和CO2 的含量与传递对细胞培养影响较大。
  • 培养基
    • 主要由无机盐类、碳源、有机氮源、有机酸、维生素、激素和一些复合物质组成。
  • 植物单细胞分离
    • 酶解法
    • 愈伤组织诱导法
  • 细胞系与细胞株
    • 细胞系（cell line）是以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。
    • 细胞株（cell strain）是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
      • 细胞株筛选
        • 一般流程
          • （1）愈伤组织诱导与培养
          • （2）单细胞分离
          • （3）细胞无性系的分离
          • （4）细胞株筛选
          • （5）性能评价
          • （6）细胞株获得
        • 定向富集驯化
          • （1）激素自养型细胞株的筛选驯化
          • （2）耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化
        • 人工诱变筛选
          • （1）悬浮培养系统
          • （2）愈伤组织系统
          • （3）原生质体系统
      • 细胞株保存
        • 1）继代培养保存法：1～2 周换液
        • 2）低温保存法：5～10℃的温度，每隔10d 左右更换一次
        • 3）冷冻保存法：（1）低温保存：−20℃左右保存细胞。（2）超低温保存：液氮（−196℃）保存
    • 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群称为亚株（substrain）
• 植物细胞悬浮培养
  • 悬浮培养（suspension culture）是指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态情况下培养。
• 植物细胞两相培养
  • 两相培养（two-phase culture）是在培养体系中加入有机溶剂或者具有吸附作用的多聚化合物，细胞在水相中生长，合成次级代谢产物，分泌出来后转移至有机相中。实现连续化培养与产物收获。
• 植物细胞小规模培养
  • 看护培养将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。看护培养（nursing culture）是指用一块活跃生长的愈伤组织（看护组织）来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法
  • 饲养层培养（feed layer culture）是指用处理（如X 射线处理）过的无活性的或 分裂很慢的细胞作为饲养细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。
    • （1）双层滤纸植板培养：在饲养层细胞和靶细胞层之间放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继续培养。
    • （2）饲养细胞与要培养的细胞共同培养于琼脂培养基中。
    • （3）饲养细胞与要培养的细胞分别培养于琼脂培养基中，前者位于下层，后者位于上层。
    • （4）饲养细胞与要培养的细胞一起培养于液体培养基中。
  • 液体浅层静置培养将一定密度的悬浮细胞接种在培养皿或三角瓶中静置培养。
  • 细胞同步化培养
    • （1）体积选择法：一定大小的筛网过滤
    • （2）冷处理法：4℃下处理
    • （3）饥饿法：控制培养液中营养成分的浓度
    • （4）抑制法：抑制细胞分
• 植物干细胞
  • 植物干细胞（plant stem cell）定义是位于植物分生组织（形成层）中具有分裂和再生能力的细胞。
    • 1）海藻酸盐固定化
    • 2）琼脂糖固定化使用琼脂糖固定植物细胞最大的优点是不需要其他离子来保证胶的稳定性。
      • （1）凝块法
      • （2）模铸法
      • （3）两相法
  • 分生组织（meristem tissue）是指植物体一定部位中具有持续或周期性分裂能力的细胞群。一小部分仍保持高度分裂的能力，大部分则陆续长大并分化为具有一定形态特征和生理功能的细胞.
    • 按位置分类
      • （1）顶端分生组织：位于根、茎及其分枝顶端。
      • （2）侧生分生组织：纵贯根、茎，位于其周围靠近器官边缘的部分，一般为1 或2 层细胞所构成的圆筒形或带状结构。
      • （3）居间分生组织：位于成熟组织之间，是顶端分生组织在某些器官中的局部区域的保留。
    • 按照细胞来源分类
      • （1）原分生组织：由始终保持分裂能力的胚性细胞——顶端原始细胞及相邻的接近原始的细胞组成的原始细胞层组成，位于根、茎及其分枝顶端的最前部分。
      • （2）初生分生组织：由原分生组织衍生的细胞组成，存在于根、茎及其分枝顶端最前方的原分生组织后面。
      • （3）次生分生组织：由成熟组织细胞经历生理上和形态上的变化，脱离原来的成熟状态（即脱分化），重新恢复细胞分裂能力而转变成的分生组织
  • 形成层（cambium）一般指裸子植物和双子叶植物的根和茎中位于木质部和韧皮部之间的一种分生组织。形成层（植物干细胞）由具有很薄且微小的细胞壁的微小细胞层构成，是植物的分裂组织，即植物的干细胞组织
• 植物细胞固定化培养
  • 细胞固定化（cell immobilization）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或固定在支持物表面，培养液呈流动状态进行无菌培养。
  • 植物细胞固定化方法
    • 常采用的固定化方法有：凝胶包埋、表面吸附、网格或泡沫材料固定、膜固定。
    • 固定剂主要是一些多糖和多聚化合物等，如海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖、明胶、聚丙酰胺等。
  • 固定化细胞的活力测定
    • 1）染色法：FDA
    • 2）呼吸强度测定：氧电极法
    • 3）细胞生长和分解速率测定：湿重法/干重法
  • 植物细胞固定化培养的生物反应器
    • 适合于植物细胞固定化培养的生物反应器主要有：流化床生物反应器、填充床生物反应器和膜生物反应器