生物技术制药

第六章酶工程制药：流化床式反应器（FBR）：适用于固定化酶进行连续催化反应，可用于处理黏度较大和含义固体颗粒的底物溶液，也可用于需要提供其他或排放气体的酶反应。

第六章 酶工程制药

• 概述
  • 酶工程简介
    • 酶工程是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术
  • 酶工程的研究内容
    • 酶的生产、酶的分离纯化、酶和细胞的固定化、酶的修饰及分子改造、非水相催化、酶传感器、酶反应器、抗体酶、人工酶和模拟酶、酶技术的应用
  • 酶的来源和生产
    • 酶主要来源于微生物细胞和动、植物细胞
    • 提取分离法：最早采用的酶生产方法，从鸡蛋清中提取溶菌酶，生长周期长，成本高
    • 化学合成法：必须知道一级结构和高级结构，成本高、反应步骤多、工艺复杂、设备要求高等缺点
    • 生物合成法（生物转化法）：生产周期短、酶的产率高、不受生物资源和气候条件影响的特点
    • 目前，利用微生物获得酶是酶制剂的主要来源，该方法的优点包括：酶的品种齐全、酶的产量高、成本低、提高产量容易
• 酶的提取与分离纯化
  • 酶制备的基本原则
    • 由于酶的特殊性，在酶的制备过程中需遵循以下原则
      • 防止酶的变性失活
      • 建立有效的目的酶跟踪监测方法
  • 酶制备的一般程序
    • 原材料的选择和预处理→酶的分离→酶的精制→酶的浓缩干燥及结晶
  • 酶的提取
    • 细胞破碎
      • 可分为物理法、化学法及生物法
      • 为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护措施
        • 采用缓冲系统、添加保护剂、抑制水解酶的作用、其他保护措施
    • 酶的提取
      • 稀酸、稀碱溶液提取：酶是两性电解质，在等电点时溶解度最小；pI在碱性范围内的酶可用稀酸提取，pI在酸性范围内的酶可用稀碱提取
      • 盐溶液提取：低浓度的中性盐可使蛋白质的溶解度增加，一般采用的盐浓度为0.05~0.2mol/L
      • 有机溶剂提取：适用于不能用盐溶法增加溶解度的酶的提取，如一些与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶，常用的有机溶剂是乙醇、丙酮和丁醇等，通常在0℃搅拌下进行
    • 沉淀分离
      • 盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、、选择性变性沉淀法
    • 酶的纯化
• 酶和细胞的固定化
  • 固定化酶的制备
    • 固定化酶的概念
      • 固定化酶是指被固定在载体或被束缚在一定的空间范围内进行催化反应的酶
      • 优点
        • 易于纯化，产品质量高；在较长时间内多次使用；提高酶的稳定性；严格控制酶反应过程；利用效率提高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；较游离酶更适合多酶反应；资源获取方便，减少污染
      • 缺点
        • 酶的活性有损失；增加生产成本；只适用于可溶性底物，较适合小分子底物，对大分子底物不适合；与完整菌体相比，不适宜于多酶反应；胞内酶通常需要经过酶的分离纯化过程
    • 固定化酶的制备原则
      • 固定化不改变酶的催化活性及其专一性
      • 固定化应有利于生产自动化、连续化
      • 固定化酶应有尽可能小的空间位阻
      • 酶与载体应结合牢固
      • 固定化酶应有尽可能高的稳定性
      • 固定化成本应适中，以利于工业使用
    • 酶的固定化方法
      • 载体结合法：将酶结合于不溶性载体上
        • 物理吸附法
          • 条件温和、工艺简便、载体选择范围很大；结合力弱，不合适的pH、温度、离子强度等条件都易使酶从载体脱落并污染催化反应产物
        • 离子结合法：通过离子键结合
          • 有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，操作简单、处理条件温和、酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶；载体和酶的结合力较弱，在离子强度较高的条件下，往往会发生酶从载体上脱落的现象
        • 共价结合法：形成共价键
          • 酶与载体结合比较牢固，有良好的稳定性及重复使用性；该法较其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失较严重
      • 交联法：利用双功能或多功能交联试剂，形成共价键
        • 制备较难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法的辅助手段
      • 包埋法
        • 条件温和、酶活力回收率高；常存在机械强度差、扩散受限制、传质阻力较大等问题，不宜催化大分子底物方式反应
        • 可分为两种
          • 网格型：高分子凝胶细微网络
          • 微囊型：高分子半透膜
      • 新型酶固定化方法
        • 耦合固定化、无载体固定化、定向固定化
    • 固定化酶的性质
      • 酶活力的改变：在多数情况下，酶固定化后的活力比天然酶小，其专一性也会发生改变
      • 酶稳定性的变化：在大多数情况下，酶经过固定化后期稳定性都有所增加
        • 热稳定性提高；对有机试剂及蛋白酶的稳定性提高；贮存和操作条件的稳定性提高
      • 酶学特性的变化
        • 底物特异性（空间位阻引起的）、最适温度提高、最适pH较游离酶偏高、米氏常数上升
  • 固定化细胞的制备
    • 固定化细胞的概念
    • 固定化细胞的制备原则
    • 制备固定化细胞的方法
    • 固定化细胞的性质
  • 酶和细胞的固定化载体
    • 固定化酶（细胞）载体的选择
      • 功能基团、渗透性和比表面积、溶解性、机械刚性及稳定性、对微生物的抵抗性、经济性和环保
    • 固定化酶（细胞）常用载体
      • 高分子载体、无机载体、复合载体、新型载体
  • 固定化酶（细胞）的评价指标
    • 固定化酶（细胞）的活力
      • 固定化酶（细胞）的活力单位可定义为每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生产物）的量，表示为μmol/（min·mg）
    • 偶联率及相对活性
      • 偶联率=（加入酶总活力-上清液酶活力）/加入酶总活力×100%
      • 活力回收率=固定化酶总活力/加入酶总活力×100%
      • 相对活力=固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液酶活力）×100%
    • 固定化酶（细胞）的半衰期
      • 在连续测定条件下，固定化酶（细胞）活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间
    • 固定化酶的热稳定性
      • 将固定化酶在不同温度下温育1小时之后，在最适温度下测酶活力，固定化酶的活力一般应保持在60%以上
  • 固定化酶（细胞）的应用
    • 固定化酶的应用
      • 用固定化酶生产各种产物、制备酶传感器、固定化药物酶
    • 固定化细胞的应用
      • 用固定化微生物生产各种产物、用固定化动物细胞生产药物
• 酶反应器
  • 用于酶催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器
  • 酶反应器的基本类型
    • 膜反应器（MR）
      • 既可用于游离酶的催化反应，又可用于固定化酶的催化反应，其中，中空纤维反应器最常见
    • 喷射式反应器（PR）
      • 利用高压蒸汽的喷射作用，高温短时催化
      • 喷射式反应器由喷射器和维持罐组成
      • 只适用于某些耐高温酶的反应
    • 填充床式反应器（PCR）
      • 设备简单、操作方便、单位体积反应床的固定化酶密度大
      • 适用于非固体颗粒或黏度小的底物溶液
    • 流化床式反应器（FBR）
      • 适用于固定化酶进行连续催化反应，可用于处理黏度较大和含义固体颗粒的底物溶液，也可用于需要提供其他或排放气体的酶反应
  • 酶反应器的选择及其性能评价
    • 酶反应器的选择
      • 根据酶的应用形式选择反应器
        • 根据固定化酶的形状、颗粒大小、稳定性
      • 根据底物或产物的理化性质选择反应器
        • 可溶性底物、小分子反应产物、底物或产物为气体
      • 根据酶反应动力学特性选择反应器
        • 酶与底物的混合程度、底物浓度、产物对酶的反馈抑制作用
    • 酶反应器的性能评价
      • 空时、空速；转化率；生产强度
  • 酶反应器的操作
    • 酶反应器操作条件的确定及其调节控制
      • 底物浓度的确定与调节控制
        • 底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素
      • 酶浓度的确定与调节控制
        • 在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度呈正比，提高酶浓度可以提高催化反应的速度
      • 反应温度的确定与调节控制
        • 根据酶的动力学特性确定酶催化反应的最适温度，并将反应温度控制在适宜的温度范围内
      • pH的确定与调节控制
        • 根据酶的动力学特性确定酶催化反应的最适pH，并将反应液的pH控制在适宜的范围内
      • 搅拌速度的确定与调节控制
        • 通过适当的搅拌实现均匀的混合
      • 流动速度的确定与调节控制
        • 通过溶液的流动实现酶与底物的混合和催化
    • 酶反应器应用的注意事项
      • 保持酶反应器的操作稳定性
      • 防止酶的变性失活
      • 防止微生物的污染
• 酶工程的研究现状与展望
  • 利用基因工程技术生产酶
  • 突变酶
    • 突变酶的概念
    • 酶定点突变的方法
      • 寡核苷酸引物介导的定点突变
      • PCR介导的定点突变：重叠延伸突变；大引物突变
      • 盒式突变
      • 循环延伸突变
    • 突变酶的应用
      • 提高酶活性及稳定性
      • 研究酶的功能基团
  • 酶分子的定向进化
    • 定向进化的基本原理
    • 酶分子体外定向进化的策略
      • 突变库的构建：随机突变、同源改组、非同源改组、结构域改组
      • 酶分子定向进化的筛选
    • 定向进化的应用
  • 抗体酶
    • 抗体酶概述
      • 抗体酶概念：抗体的高度选择性和酶的高度催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活性的免疫球蛋白，在其可变区域赋予了酶的属性，是一种新型的人工酶制剂
      • 抗体酶的特点
        • 能催化一些天然酶不能催化的反应
        • 更高的专一性和更好的稳定性
        • 催化机制不同
      • 催化反应类型
        • 氨基转移反应；重排反应；金属螯合反应；磷酸酯水解反应
    • 抗体酶的制备方法
      • 稳定过渡态法、熵阱法、抗体与半抗原互补法、抗体结合部位修饰法、蛋白质工程法、抗体库法
    • 抗体酶的应用
      • 在前药设计中的应用、在疾病治疗中的应用、在有机合成中的应用
  • 酶的呼吸修饰
    • 酶化学修饰的概念
      • 利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某部分删除或置换，改变酶的理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子进行改造的技术称为酶的化学修饰
    • 修饰酶的特点
      • 热稳定性提高、抗原性减弱、半衰期延长、最适pH改变、酶学性质改变
    • 酶化学修饰的方法
      • 酶表面的化学修饰：大分子修饰、小分子修饰、交联修饰、固定化修饰
      • 酶分子内部修饰：非催化活性基团的修饰、酶蛋白主链的修饰、催化活性基团的修饰、与辅助因子有关的修饰
      • 定点突变和化学修饰结合技术
    • 化学修饰酶的应用
  • 非水相酶催化
    • 非水相酶催化的概念
    • 非水相酶反应的特点
      • 减少水引起的副反应；有利于疏水性底物的反应；热力学平衡向产物方向移动；提高酶的稳定性；酶不溶于有机溶剂，易于回收利用；从低沸点的溶剂中易分离纯化产物；无微生物污染
    • 非水相酶反应的溶剂体系
      • 水-水溶性溶剂均相体系、水-水不溶性溶剂两相体系、反相胶团（束）体系、单相有机溶剂体系、超临界流体介质体系
    • 有机相酶促反应的主要影响因素
      • 水含量、有机溶剂、酶、固定化载体、pH
    • 酶非水相催化的应用
      • 手性药物的拆分、功能高分子聚合物的合成、精细化工产品的生产
  • 模拟酶
    • 模拟酶的概念
      • 根据酶的作用原理，用各种方法认为制造的具有酶性质的催化剂
    • 模拟酶的分类
      • 主-客体酶模型、胶束模拟酶、肽酶、半合成酶、印记酶
    • 模拟酶的研究意义与展望
• 酶工程在制药工业中的应用
  • 固定化酶法生产L-氨基酸
  • 固定化酶法生产β-内酰胺类抗生素