2022.10.08~2022.10.14呼吸道冻干（MRP

这是一篇关于2022.10.08~2022.10.14呼吸道冻干工作进展（MRP的思维导图，主要内容有冻干程序优化、微球热加速变小问题分析及解决办法、呼吸道样本确认等。

2022.10.08~2022.10.14呼吸道冻干（MRP）冻干工作进展

• 冻干程序优化
  • 冻干配方不改变，基于之前微球37℃热加速12天后微球比刚出箱时略变小，怀疑是微球含水率偏高，于是对冻干曲线进行优化，主要是减少一次干燥时间，延长梯度解析时间以此足够降低微球含水率，解决微球热加速后微球略变小的现象。2022.10.09调整程序冻干了一批微球，2022.10.11出箱，这批微球有些与西林瓶接触面呈现半球分布，复溶后检测500copies的样本能检出（IAV/IBV/SARS-CoV-2/MP/hRV/RSV），但10.11将此批微球放置37℃热加速2天后和常温放置微球相比略变小了一些，说明此种调整冻干曲线方式并未解决该问题。
• 微球热加速变小问题分析及解决办法
  • 1.调整了一次冻干程序未解决，于是查看冻干机历史运行程序在解析阶段的压力变化情况，发现在梯度解析阶段温度升高压力升到一个高值下降到低值速度较慢，这个现象原因有2点一是一次干燥的时间不够，二是一次干燥的温度太低导致梯度解析压力偏高进而影响含水率控制，与厂家交流冻干机在解析阶段空载压力变化不大，但放置样品后梯度解析压力变化处于较高状态，给的建议与自己分析一致；2.对冻干体系配方微调，去掉低Tg值辅料，增加赋形剂与填充剂的使用量。
• 呼吸道样本确认
  • 由于之前使用的呼吸道样本是由新材料包装的慢病毒，样本存在一定的质粒残留或降解，会造成后续冻干体系优化阻力，2022.09.30从-80℃冰箱找出呼吸道样本进行定值，IAV样本未定出值，IBV（第三方质控品）、ADV（新材料）、RSV-A/B（新材料）、hRV（临床）、MP（新材料），IAV无值，其余均有值，无值的IAV用之前能做出的样本，此IAV样本也是新材料提供，样本值来源于代庭伟，按照定值结果稀释至500copies/mL柱提，用冻干体系检测，ADV，临床hRV未检出，于是将未检出的样本提高至4E3copies/mL柱提后分别稀释至2E3/1E3/500，ADV只有4E3/2E3检出，hRV样本未检出，之前用的hRV样本500copies能检出。目前已确认手上样本的可用性，可用于下一步冻干体系优化。
• 冻干体系优化
  • 主要包括两方面：一是在确认好样本的可用性后进行每测试反转录用量调整，做此实验的目的是反转录酶低温发挥Taq酶活引起NTC引物二聚体问题，基于之前实验结果设计3个实验组，对照组60U/测试，实验组分别为30U、50U/测试，结果显示降低每测试反转录酶用量并不能解决NTC问题，但阳性在50U时没有显著差异，考虑试剂成本，还是可以降低用量；二是往冻干检测体系中加入Se核酸解决NTC问题，设置了3组实验，对照组只含dNTP、实验组1dNTP:Se核酸（80:1）、实验组21dNTP:Se核酸（100:1），结果显示两组不同添加量的Se核酸并未解决NTC问题，但对阳性样本检测无显著影响。PS：Se核酸原液浓度太低，结合体系情况只能选择上述实验比例，可能添加量太少以至于达不到理想效果。
• 第二批冻干微球37℃热加速&常温12天性能验证
  • 热加速微球与刚出箱及常温微球相比还是略变小了，但微球复溶后不影响检测，IAV/IBV/MP/hRV/SARS-CoV-2/RSV-A500copies均检出，靶标熔解峰未受显著影响，ADV因之前样本确认有问题未做。第一批微球热加速12天后靶标峰显著降低，分析其原因：两批微球使用的解析程序一样，冻干配方一样，唯一的不同是第一批冻干微球使用的保护剂为配制多天后直接取用进行冻干体系试剂配制，第二批冻干微球制备使用的保护剂是现配的，怀疑是冻干保护剂各组分制作成mix后放置过程中发生微观的溶液性质变化，削弱了保护剂对酶等保护效力，因此后续制备微球的保护剂尽量现配现用。PS：配制的复溶液&保护剂放置多天并不影响冻干体系液体测评。
• 配合仪器老师进行冻干试剂与仪器配套验证
  • 给5楼仪器老师提供了一批2022.10.12出箱冻干微球配套仪器验证，包含样本（ADV/IAV/IBV/SARS-CoV-2/MP/hRV/RSV-A），测试结果待反馈。
• 冻干配方优化
  • 针对热加速过后微球比常温与刚出箱时略变小，去掉冻干辅料PEG-2000，增加甘氨酸、甘露醇、BSA用量，从调整配方这个方向解决这个问题，冻干后复溶结果与热加速结果待验证。
• 冻干试剂配套POCT提取
  • 目前还是为提取提供复溶液5+未更改的冻干保护剂进行测试