WB实验步骤流程

从蛋白提取到显影成像，涵盖Western blot的详细操作流程步骤，每步都有照片解说，非常适合新手。

WB实验

• 蛋白提取
  • 组织样品蛋白提取
    • 试剂耗材准备
      • 要准备好蛋白酶抑制剂
        • 1颗药片加1ml溶解，得50X蛋白酶抑制剂。最终加入到裂解液中1X使用
        • 要现用现配
      • 裂解液
    • 操作步骤
      • 取组织
        • 放在干冰上取，黄豆大小
          • 减组织过程中最好无菌状态
          • 一般取20-30mg组织（肝脏）
            • 脂肪组织取50mg（100mg也可，但是不同样品之间的质量尽量接近）
      • 放入离心管
        • 每个离心管提前装好了4-5颗钢珠，以及600ul裂解液（裂解液根据样品质量按照比例换算）
          • 组织与裂解液的质量比例
            • 肝脏组织，肝脏：裂解液=1:20
              • 肝脏的蛋白含量比较高
            • 脂肪组织，脂肪：裂解液=1:5
              • 脂肪的蛋白含量比较低
          • 装钢珠的小管放在冰浴里即可
      • 研磨180s
        • 参数
          • 200s，60Hz。设置好后直接启动即可
            • 如果觉得研磨不充分，可以再研磨一会。但是注意避免温度过高
        • • • • • 注意样品与铁盖之间要放几层纱布
        • 研磨后取走钢珠
          • 可以先把液体吸出来，倒出钢珠后再把液体放回去
      • 超声40s
        • 开关
          • 就是竖线和圆形按钮
        • 参数
          • 时间长度1min（timer），5s静止，5s脉冲。振幅一般是50%
            • 超声头要在管底上一点点，不能碰着底和管壁
      • 第一次离心
        • 4度，12000g，10min
          • 取上清液400ul至新的离心管中
      • 第二次离心
        • 4度，12000g，10min
          • 取上清液200ul至新的离心管中
            • 如果还有较多油脂可以再次离心
      • 也有的人直接一次性离心15-30min
      • BCA定量(这一步非必须操作)
        • 稀释蛋白样品
          • 取10ul蛋白样加入到90ul裂解液中，稀释10倍
            • 或者稀释20倍(有人直接用PBS稀释)
        • 取10ul稀释后的蛋白样加入到96孔板里(一个样一个小孔，每孔10ul)
          • 或者25ul稀释后的样品
        • 在上述小孔里补加200ul工作液
          • 该工作液需提前配置好，由A液：B液=200ul：4ul混合得到
            • 工作液要现配
          • A液
            • • 直接取的试剂盒里原液，不用稀释
          • B液
          • 这两个都来源于试剂盒
        • 设置2个对照孔（一个水，一个裂解液）
          • 只加200ul工作液
        • 37度反应15-20min
          • 若颜色变化小，可以放入60度烘箱，直到出现比较明显的颜色变化
        • 酶标仪检测吸光度定量
          • 波长为562nm
        • 根据吸光度计算、定量
      • 煮样
        • 样品准备
          • 根据上述BCA定量结果，确定蛋白样品需要的体积
          • 补加裂解液体积
            • 应该是等于总体积150ul减去蛋白体积
          • 再加50ul 4Xloading buffer（跑胶加样用的2Xloading），混匀
            • loading buffer的功能
              • 指示剂作用
              • 打开二硫键
              • 有助于保存蛋白
            • 确保最终loading buffer使用的是1X浓度
        • 95度，10min
          • 跑胶之前要重新煮。再次煮样5min，10min都可以
        • 其他
          • 可以直接将上述提取的蛋白样品一次性全部煮了
          • 煮好之后可以放负40度保存好几个月
    • 其他
      • 提蛋白过程中对无菌要求不高
  • 细胞样品蛋白提取
    • • 跟提组织蛋白基本差不多，只是不用研磨，也不用定量（可能是细胞样品量比较精确）
    • 某常用步骤
      • 不用常规裂解液，改用SDS lysis buffer
        • • 6孔板，每个孔200ul
      • 用枪头刮一会之后，95度20-30min(这步煮样不用加loading)
      • BSA定量
        • 上面有详细步骤
• 跑胶
  • 其他
    • 想跑齐一般根据灰度定量来确定样品用量，先跑一次
  • 配件试剂等
    • running buffer
      • running buffer用10X配好的稀释（纯水稀释）
      • 回收buffer可以放在槽子外面
    • loading以及mark等
    • 浓缩胶，分离胶配置方法
    • WB用的胶可以在冰箱里放1-2个星期
  • 上胶
    • 拔梳子
      • 调正
  • 上样
    • 1.5mm的胶可以上样25ul
      • 不精确计算的话，每个孔可以直接加10ul的样品
        • 最好是提前算好每个样的加样体积，这样有助于跑整齐
      • 加样过程中，注意把样品摇匀再加样
    • 1mm的胶可以上样10ul，顶多加15ul
    • 其他
      • 上样前要重新煮样。95度，10min。煮样之后要离心（高温煮的过程中水滴可能会凝结在管壁上面）
      • 机器设备
        • • 所有机器设备是一样的
            • 跑胶和转膜用的一样的机器设备
      • • 注意两个槽子是有区别的
    • loading与mark加样体积与样品体积一样。可以都加7ul
      • loading加样浓度是2X的
        • 浓度太高或太稀都不好
    • 上样顺序等安排
      • • 最右边的L是loading的缩写
          • 感觉mark不要放在loading的外面，容易被挤变形
    • 正负极问题
      • 红色线连红极，黑色线连黑极
  • 跑胶参数
    • 浓缩胶
      • 80v，20min
    • 分离胶
      • 120-130v，1小时以上
        • 可以把电压调小一点如80-90v，跑慢一点。跑的越慢越好看
    • 也有人说这步可以不用调参数，关键不要停，只要目标蛋白可以分开（比如居中即可）
  • 跑胶跑好的状态
    • • • 只要条带跑开就行
          • 跑完了最好尽快转膜，否则蛋白容易散开
• 转膜
  • 转膜液一般用80%甲醇的转膜液
    • 实验室的转膜液一般用500ml就够了
      • 转膜要在冰浴条件下
    • 实验室的转膜液是10X的，要稀释
    • 配置方法：取40ml10X的转膜液，加360ml纯水，再加100ml甲醇（桶装）
  • PVDF膜要用甲醇激活
    • • 裁剪尺寸8.5X5.5cm
    • 浸泡一会即可
      • 目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合
    • PVDF 膜典型结合量是 100-200ug/cm2（结合强度 PVDF 比硝纤膜强 6 倍）。通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的蛋白建议选择0.2um孔径的膜
  • 转膜过程
    • 先放1-2层棉布
    • 再3层以上滤纸
      • 滤纸多点无所谓，每次可以加放一层
        • 自己裁剪
    • 保持湿润状态
    • 取、放胶
      • 先倒一些转膜液到铁盘里
      • 一些细节
        • 胶板浸泡一些液体进去
          • 把胶上的玻璃用力抠开
            • 切掉锯齿胶
              • 胶四周切一下
                • 松动胶
                  • 胶取到PVDF膜上
                    • 盖上（白色板子盖到黑色板子上）
    • 放PVDF膜
      • 放胶过程中胶不用换面（翻转），样品端朝下即可
      • 贴胶的一面要做标记（中性笔即可）
        • 中性笔标记后，晾干了再放入甲醇中激活，否则很容易洗掉
    • 再放棉布
      • 转膜过程中，棉布太多了或太少了都不好
    • 转膜参数设置
      • • • 黑色板要放在负极
      • 一块胶的情况
      • 260mA，1h（务必确认这里是260mA，不是v）
        • 还要调成恒流模式。A/V调成mA
  • 转膜槽清洗
    • 用水冲洗即可
  • 转膜这步结束了，可洗可不洗，然后封闭
• 封闭
  • 5%脱脂奶粉封闭转膜好的PVDF膜
    • 40min-2h，时间太长了也不好
      • 封闭1h就够了
    • • 奶粉用TBS来溶解，实验室的TBS是20X的。用纯水稀释至1X后再使用
    • • 最下面刻度线是200ml
        • 取10ml 20X的TBS稀释到200ml，加10g脱脂奶粉
  • 牛奶封闭完后，用1%的吐温20洗（用1XTBS配置）。洗3遍，每次5min
    • • WB里所有的洗涤操作都是用TBST来进行的。洗3次，每次5min
        • 很多时候水池旁边有，可以直接使用
          • 1%TBST的配置方法是1L 1X的TBS溶液（即50ml 20X的TBS）加1ml的吐温
• 抗体孵育
  • 1、剪膜
    • 注意保持膜不要干。另外一只手套剪掉三边即可，保留一边连接，否则容易动
    • 剪膜时注意每块的正面都要标记好
    • 剪膜不好判定方向时，可以结合泳道形状判定（月牙形是朝上的）
  • 2、一抗孵育
    • 抗体一般加6-7毫升
      • • 提前稀释好在4度冰箱里可以放很久，半年都没有多大问题
        • 一抗用专门的一抗稀释液稀释
      • 一抗的孵育时间可从数小时至过夜不等（一般不超过18h），具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度。建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证抗体与蛋白的特异性结合
    • 冰箱里摇床孵育过夜即可
      • • 一抗一般孵育过夜，或者更长时间也无所谓。孵育时间长了用TBST多洗一下即可
        • 一抗孵育完了，抗体要回收
          • 回收一抗时，最好在冰浴条件下进行
    • 孵育完后TBST洗涤，洗3次。每次5min
      • 洗涤时TBST不用太多，没过PVDF膜即可
    • 一抗如果有沉淀的情况，用枪头把沉淀吹打起来再一起孵育
  • 3、二抗孵育
    • 二抗选择
      • 一抗用什么来源的，二抗就用什么来源
    • 二抗用之前配置好的5%脱脂奶粉稀释，稀释5000倍。
      • 孵育时间也是1h
        • 孵育完后二抗不用回收
        • 孵育完后如果来不及显影，可以加点TBST放在4度存放
      • 二抗使用量跟一抗差不多，5ml够了
        • 孵育二抗在室温条件下进行即可
      • 位置
    • 孵育完后TBST洗涤，洗3次。每次5min
      • 多洗一下无所谓，洗2-3小时都可以，洗的时间长点背景反而干净
• 显影
  • 显影液
    • • • 大瓶是弱显，小瓶是强显
        • 深色瓶子是原液，白色瓶子是稀释液
          • 按照1:1配比即可使用。一般各取1ml加在一起即可
  • 准备过程
    • 用纱布把孵过二抗的PVDF膜吸干
      • • • • • 放置PVDF膜时要正面朝上（此前做了标记的面朝下）
    • 建立目标文件夹用于存放数据
  • 成像过程
    • 点击新建（实验协议）
    • 目标蛋白成像参数设置
      • • • 成像参数设置例如：第一张图片成像时间可以设置1s，最后一张设置10s，总共成像10张图片。后面可以根据实际情况修改成像参数
    • mark成像
  • 显像过程
    • 正面朝上，过曝就是红色
  • 数据处理
    • 目标条带与mark合并
      • 同时打开目标条带与mark数据
      • 点击图像工具
      • 点击合并
      • 保存数据（点击合并后的数据再点保存）
  • 数据保存
    • 选择曝光效果合适的成像结果保存（右击保存即可）
      • • • scn格式即为原始数据格式
  • 导出图片
• 数据分析
  • 软件安装包
  • 定量分析
    • • 注意这些矩形的大小要一样