谷氨酸棒状杆菌高效生产β-丙氨酸的系统代谢工程

谷氨酸棒状杆菌高效生产β-丙氨酸的系统代谢工程梳理，包括β-丙氨酸简介、β-丙氨酸的合成、实验流程、材料和方法、结果等等。

谷氨酸棒状杆菌高效生产β-丙氨酸的系统代谢工程

• β-丙氨酸简介
  • 一种非蛋白源性β-氨基酸，β-丙氨酸是泛酸和辅酶a 的前体
  • 工业应用：肌肽（对肌肉有作用的一种二肽）的组成部分
• β-丙氨酸的合成
  • 化学合成（主要）
    • 设计有毒前体；条件恶劣
  • 生物合成
    • 酶促反应
      • • 富马酸通过酶促反应生成β-丙氨酸。但是富马酸来自石油，不可持续。
    • 微生物生产
      • 主要应用大肠杆菌，例如通过表达谷氨酸棒状杆菌panD基因(编码ADC)和过表达大肠杆菌aspA和acs(分别编码天冬氨酸解氨酶和乙酰辅酶a合成酶)构建工程大肠杆菌。
  • 局限
    • • β-丙氨酸的效价和产率仍需进一步提高，以满足工业需求。
  • 解决办法
    • 通过谷氨酰胺ATCC 13032的系统代谢工程构建了一种高效的β-丙氨酸生成菌
• 实验流程
  • 1.研究了来自7种不同细菌的adc，以确定谷氨酰胺中β-丙氨酸的最佳生物合成途径。
  • 2.通过基因组规模的代谢模拟来预测基因操作靶点，从而优化磷酸化转移酶系统(PTS)独立的葡萄糖摄取系统以及关键前体(即草酰乙酸和l -天冬氨酸)的细胞内供应
  • 3.设计了TCA循环，以更好地供应关键的前体
  • 4.发现了一个新的β-丙氨酸输出源，并通过过表达增强β-丙氨酸的生成。
• 结果
  • 对产生的β-丙氨酸过剩菌株进行补料分批发酵，结果β-丙氨酸产量为166.6 g/L，葡萄糖产量为0.28 g/g，产率为1.74 g/L/h，为通过微生物发酵生产β-丙氨酸铺平了道路。
• 总结
  • 采用一系列代谢工程方法，在基因组尺度代谢模拟的辅助下，开发了一种高效的谷氨酰胺β-丙氨酸产生物。
  • 通过筛选构建β-丙氨酸生产基株后，进行进一步的工程设计，包括优化不依赖于pts的葡萄糖摄取系统，优化关键前体(草酰乙酸和l -天冬氨酸)胞内供应，优化TCA循环。
  • 新发现了一个β-丙氨酸出口分子，对β-丙氨酸的生产产生了积极的影响。
  • 经5 L补料分批发酵，最终工程菌株产β-丙氨酸166.6 g/L，产糖率0.28 g/g葡萄糖，产糖率1.74 g/L/h。在β-丙氨酸的微生物发酵研究中，本研究获得的β-丙氨酸滴度、产量和生产力是迄今为止报道的最高的
  • 本研究表明谷氨酰胺可作为增强β-丙氨酸生产的有竞争力的微生物基质。
  • 本文所描述的系统代谢工程策略也可用于利用谷氨酰胺高效生产其他增值化学品。
• 材料和方法
  • 菌株和培养条件
  • 克隆与表达
    • 基因编辑操作
      • 两步同源重组法
    • PCR
      • 子主题
        • C1000热循环仪(Bio-Rad)
    • 质粒
    • 引物
      • Neoprobe合成
  • 谷氨酰胺基因组尺度代谢模型的基因操纵靶点预测
    • FSEOF用于识别过表达靶点，这些靶点对应的生化反应显示通量与β-丙氨酸生成通量呈正相关。FSEOF使用Cameo 实现，葡萄糖摄取速率设置为4.67 mmol/gDCW/h。
    • 通过比较β-丙氨酸生产菌株中每个反应的预测通量范围和野生型中相同反应的通量范围来确定过表达和下调靶点。
  • 补料分批发酵
    • 将C. glutamicum细胞接种到20mLBHI培养基中，并补充20g/L的葡萄糖，摇瓶30℃发酵12h。
    • 转移到70 g / L葡萄糖,20 g / L (NH4) 2 so4、尿素5 g / L, 1 g / L KH2PO4, 1 g / L K2HPO4, 10 g / L酵母提取物,10 g / L牛肉膏,0.25 g / L MgSO4•7水,0.03 g / L原儿茶酸,微量金属溶液5 mL/L，生物素200 μg/L，硫胺-盐酸500 μg/L的培养基中，发酵24h。
    • 将种子(10%接种v/v)转移到5 L生物反应器(Bioflo 320)，发酵培养基为120 g/L葡萄糖、40 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、2 g/L KH2PO4、2 g/L K2HPO4、10 g/L酵母浸膏、2 g/L MgSO4•7H2O、5 mL/L微量金属溶液、200 μg/L生物素、500 μg/L硫胺- Hcl。用28% (v/v)的氢氧化铵溶液将pH值维持在7.0。通过自动以2 L/min的速度提供空气和纯氧的混合物，并自动将搅拌速度控制在600 ~ 1000 rpm之间，使介质中的溶解氧(DO)水平保持在30% (v/v)。饲喂溶液为700 g/L葡萄糖，40 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L酵母提取物，5 g/L MgSO4•7H2O。当pH值高于设定值(即pH值为7.03)(变碱性)时，间歇式加液10.7 mL/min，当pH值低于设定值时自动停止加液。
  • 糖和β-丙氨酸的定量
    • 高效液相色谱法测定丙氨酸和其他代谢物浓度
    • 折光仪测糖