紫外可见分光光度器

紫外可见分光光度计一般指紫外-可见分光光度计。 紫外-可见分光光度计是基于紫外可见分光光度法原理，利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射吸收来进行分析的一种分析仪器。主要由光源、单色器、吸收池、检测器和信号处理器等部件组成

紫外可见分光光度器

• 基本结构
  • 光源
    • 可见光区：钨灯作为光源，辐射波长范围320-2500nm
    • 紫外区：氢，氘灯作为光源，可发射185-400nm的连续光谱
  • 单色器
    • 由棱镜，光栅，狭缝和准直镜等部分组成
  • 吸收池
    • 石英：适用紫外和可见光区
    • 玻璃：只能用于可见光区
  • 检测器
    • 光信号转化为电信号，多用光电管和光电倍增管
  • 信号显示系统
• 基本概念
  • 原理
    • 根据物质对紫外光（200-400nm）及可见光（400-780nm）的特征吸收而建立的分析方法，其定量依据是光的吸收定律，即朗伯-比尔定律
  • 朗伯-比尔定律
    • 物质对光选择吸收的程度与物质浓度及液层厚度之间的关系
    • A=KCb
    • K有三种表示方法
      • 浓度以g/L为单位时，称为吸光系数
      • 浓度以摩尔浓度为单位时，称为摩尔吸光系数
      • 不知道分子量的物质，采用百分浓度为单位，称为百分吸收系数
  • 定量分析的方法
    • 直接比较法：标准对比法（临床最常用），在测定未知样品浓度的同时，与已知浓度的标准物比较，分别测出试样溶液及标准溶液的吸光度A（x)及A（s)，进行比较可得样品的浓度。
    • 标准曲线法：配置一系列浓度不同的标准溶液（一般为5-8个），以不含有被测组分的空白溶液作为参比，在相同的条件下选定波长测定标准溶液的吸光度，然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C标准曲线。
    • 摩尔吸光系数检测法：许多脱氢酶活性的测定以及用脱氢酶做指示酶的代谢物测定多采用此法
    • 双波长分光光度法
• 类型
  • 单光束可见分光光度计
    • 单光束可见光分光光度计：只能在可见光区内工作，无紫外光范围。
    • 单光束紫外-可见分光光度计：既有可见光区的光谱，又有紫外和红外光区的光谱，适用波长范围为200-1000nm。
  • 双光束分光光度计
    • 是指在单色器的出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或斩波器，作用是以一定的频率将一个光束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接受或两个检测器分别接受两路信号，以求能有效地提高分辨率和降低杂散光，还可自动补偿监测时因条件的随机变化或样品中非测定组分的干扰所引起的影响，比单光束分光光度计使用更方便、准确；消除干扰减少误差，并可作全波段光谱扫描。
    • 是目前国内外使用最多，性能较为完善的分光光度计。
  • 双波长分光光度计
    • 同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器分光后得到两束不同波长的单色光，经过切光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，然后经过检测器显示出两个波长下的吸光度差值，
• 分光光度计分析条件的选择
  • 入射波长的选择：选择最大吸收吸收波长的单色光为入射光，以得到最大的测量灵敏度，称为最大吸收原则。
  • 吸光度波长范围的选择：选择适宜的吸光度范围，以保证测量结果的误差最小，在相关噪声试验中发现吸光度范围为0.1-2.0时，测定结果的相对误差最下。
  • 狭缝宽度的选择：狭缝宽度增大，入射光的単色性降低，在一定的程度上会使得灵敏度减低，标准曲线偏离朗伯比尔定律。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的1/10.
  • 显色反应条件的选择
    • ①反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔系数较大
    • ②反应应有较高的选择性，被测组分经反应生成的化合物的吸收曲线与其他共存组分的吸收光谱有明显的差别
    • ③反应生成物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不改变
    • ④反应生成物的组成恒定
• 2019级检验班 权菲芸 201912104026