蛋白质浓缩和溶质去除

蛋白质纯化-浓缩与溶质去除操作思维导图，包括：层析、电泳、透析、超滤(UF)、冷冻、干燥、沉淀、结晶。

蛋白质浓缩和溶质去除

• 层析
  • 凝胶过滤
    • 广泛用于非变性情况下蛋白质脱盐，大分子蛋白质不会进入树脂小孔中，在流动过程中将盐分除去
    • 通常情况下，填料体积是样品体积4~20倍，柱长与柱径比值在5~10时，分辨率最佳，脱盐过程中样品最少被稀释1.25倍
  • 离子交换层析
    • 大尺寸的颗粒和表面修饰的混合床离子交换（IEX）树脂可有效的捕捉小分子阴离子和阳离子（<1000Da）,最小限度截流高分子质量蛋白质分子
    • 可能造成不良后果：常规IEX吸附剂混合床发生的离子交换可能引起蛋白质样品的酸化和沉淀
    • 在脱盐过程中会发生蛋白质样品的稀释，因此可能在后续处理时需要对蛋白质进行稀释
  • 反向层析
    • 分离，脱盐，浓缩蛋白质一项很流行技术，一定程度是由于样品被浓缩在小体积可通过蒸发二去除的挥发性溶剂中
    • 通常情况下在pH<4和有离子配对剂（如0.1%~1.0%TFA）存在情况下可使蛋白质和纯化柱中的胶实现最佳结合
    • 有机组分存在时，可能会促进蛋白质与纯化柱的胶可逆结合，一般为15%乙腈或甲醇，或离液剂（如盐酸胍）等
    • 如果含有去污类污染物，则需要对样品稀释防止其干扰蛋白质与吸附剂的结合
    • 脱盐操作需要对树脂进行清洗，如5%甲醇，1%TFA
  • 疏水和亲和层析
• 电泳
  • 通过凝胶电泳进行蛋白质浓缩通常应用于随后分析技术，增强灵敏度
  • WB灵敏度可以通过应用高达250uL蛋白质样品，在微型凝胶系统1~2cm的积层胶上连续进行5次以上加样得到增强
  • 毛细管电泳法（CE）可通过堆积作用实现蛋白质样品的浓缩
• 透析
  • 基于分子质量大小的液相分离技术，由透过半透膜的选择性透过半透膜选择性扩散来实现
  • 影响透析产品回收稳定性条件
    • 缓冲液交换所需时间，透析系统设计，透析膜化学和形态学特征
  • 使用透析膜进行蛋白质浓缩
    • 使用试剂（如聚乙二醇，葡聚糖等聚合物），产生一个双向系统，透析膜将这两相分开
• 超滤（UF）
  • 与透析的区别
    • 1.应用：透析主要应用于溶质或缓冲液的交换，超滤主要应用于缓冲液交换或产品浓缩
    • 2.操作模式：透析是通过由半透膜两边的浓度差所驱动的扩散传质作用而进行的，超滤主要是由莫两边的压力差所驱动的传统的传质而起的作用
    • 3.膜的作用：超滤的膜的机械强度比透析膜大
  • 几种超滤方式
    • 1.真空过滤：真空作用下驱动透过膜进入到收集容器中
    • 2.针头式滤器：超滤膜与塑料支撑板结合并封闭于小的盘状单元，配备有鲁尔接头，可以连接到注射器
    • 3.离心式过滤器
    • 4.多孔滤板：超滤膜整合至96孔板或384孔板的多孔过滤板中，用于小样品量的高通量浓缩或缓冲液交换
    • 5.搅拌单元装置：将平板超滤膜盘放置于一个合适支撑板上，密封于圆柱形外壳底部，液体通过悬挂与顶端的一个磁力搅拌棒进行搅动，使用空气作为压力驱动液体进行超滤
• 冷冻干燥
  • 溶液中溶质的浓缩可以从热力学上通过驱使溶剂变成气态进入顶部空间或煮沸实现
  • 不稳定溶质，如蛋白质分子可以被用来出去溶剂所需的热量快速降解
  • 在冷冻干燥过程中，样品的温度比溶液凝固点要低，溶剂通过升华而被去除，冷冻和真空可同时进行，热量和顶部空气在此时被去除，从而进行产品的浓缩
  • 主要步骤
    • 1.冷冻 冷冻速率会影响最终产品质量
    • 2.初级干燥 通过升华作用，＞80%的溶剂从固态直接变为气态，残留的溶剂
    • 3.二次干燥 在二次干燥中，溶剂残留的吸附降低到足以抑制微生物生长或化学反应发生的潮湿水平，同时扔能保持冻干产品的活性或者完整性
• 沉淀
  • 通过加入某种试剂改变蛋白质溶解度，从而将蛋白质从一种溶液以固体形式分离出来
  • 通常成本低廉，易于放大
  • 往往在包含有DNA，脂类和杂质蛋白质的初始初始料液中进行
  • 可以通过加入中性盐，有机溶剂，非离子型亲水聚合物，多价金属离子等诱导，或通过加入酸碱来进行等电点沉淀
  • 影响蛋白质最重要因素时，结构，大小，电荷，溶剂
  • 常用沉淀剂
    • 丙酮 向蛋白质样品中加入4：1冷丙酮，，混合，离心，上清液丢弃
    • TCA三氯乙酸 向蛋白质中加入同等体积20%TCA，冰浴30min，4℃离心，弃去上清液。然后将片状沉淀用冷丙酮（－20℃）洗涤，4℃再次离心，弃上清液，干燥
    • 硫酸铵 水溶性极高，对蛋白质的生物活性无有害作用
    • 聚乙二醇 使用相对分子量大于4000的聚乙二醇更易进行蛋白质沉淀
• 结晶
  • 可同时浓缩，纯化，和稳定蛋白质产品
  • 主要4个变量控制结晶和形态回收：蛋白质浓度，沉淀剂浓度，pH，温度