细菌检验学技术

细菌检验学技术概括，包括样本的采集与送检原则、细菌的分离培养方法、细菌的生化反应检查法、细菌的形态结构检查法、细菌的血清学检验等。

第二章细菌检验学技术

• 第一节样本的采集与送检原则
  • 一、 采样一般原则
    • 1.无菌原则 样本采集和送检均需遵守无菌原则。 2.选择正确采样时间 3.选择正确采样部位 4.采集足够量样本 5.多样性采集 6.做好采样记录
  • 二、 样本运送原则：选择适当的温度和时间；选择正确的气体环境；保持密闭状态；
• 第二节细菌的分离培养方法
  • 培养基制备
    • 主要成分及其作用
      • 营养物质：
        • 氮源 碳源 无机盐 生长因子
        • 蛋白胨：提供氮源；特点是易溶于水,吸水性强,故须干燥密封保存
        • 肉浸液：氮源、碳源物质及一些生长因子
        • 牛肉浸膏:肉浸液加热浓缩而成的膏状制品。
        • 糖、醇类:细菌生长繁殖所需碳源、能源
        • 血液
          • 含蛋白质，氨基酸，无机盐，糖类等营养物质 提供辅酶，血红素和特殊的生长因子 用于培养营养要求高的细菌 根据细菌在血液培养基中的溶血现象进行鉴定
        • 无机盐类（提供各种元素）
        • 鸡蛋和动物血清（特殊培养基）
        • 生长因子
      • 水分
      • 凝固物质
        • 最常用的凝固物质 是琼脂；琼脂在98℃以上融化，在45℃以下凝固
      • 抑制剂和指示剂
        • 抑制剂：目的在于抑制非检出菌的生长，有利于检出菌的生长 常用的有：胆盐，煌绿，亚硫酸钠，亚硒酸钠，染料，某些抗生素
      • 指示剂
        • 目的：为了便于观察细菌是否利用和分解培养基中的糖，醇类
        • 酸碱指示剂：如酚红、 漠甲酚紫、漠麝香草酚蓝、中性红、甲基红、酸性复红等
        • 氧化还原指示剂：美蓝最为常用，氧化型为蓝绿色，还原型为无色。
    • 制备培养基的一般程序
      • 调配按培养基的配方
      • 矫正pH：7.4~7.6
      • 过滤澄清
      • 分装
      • 灭菌：耐高压培养基可用高压蒸汽灭菌器进行常规灭菌（121℃ ,20分钟）；某些含 糖类的培养基可选择115℃, 15分钟；不耐高压的培养基：灭菌滤器除菌（如含有血清、尿素或某些糖类的培养基）。含牛奶和鸡蛋的培养基：间歇灭菌法处理
      • 质量检定
      • 保存培养基的贮存主要是防止干涸、变质和污染三个方面。
    • 培养基的种类
      • 物理性状
        • 固体培养基(solid medium)：琼脂用量为2%〜2.5%,按存在形式又分为平板、斜面、高层及高层斜面,用于细菌分离培养、鉴定及增菌
        • 半固体培养基(semisolid medium)：琼脂用量为0.5%~1%,用于观察细菌的动力、分类鉴定、保存菌种以及噬菌体效价滴定
        • 液体培养基(liquid medium)：主要用于增菌、生化试验
      • 成分
        • 合成培养基；
        • 天然培养基
      • 用途
        • 基础培养基(based medium)：仅含有多数细菌生长繁殖所必需的最基本营养成分的培养基，如普通肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等。
        • 营养培养基(nutrient medium)：满足对营养要求较高和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖；血琼脂平板，巧克力平板，血清肉汤培养基
        • 增菌培养基(enrichment medium)：增加被检菌的数量，提供足够菌量的培养基
        • 选择性培养基(selective medium)：增加选择性抑菌物质或改变培养基理化环境，抑制杂菌生长以利于目的菌的检出
        • 鉴别培养基(differential medium)：细菌分解糖类和蛋白质等的能力及其代谢产物的不同，用于检查各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细菌
        • 厌氧培养基(anaerobic medium):培养专性厌氧的细菌 巯基乙醇酸钠培养基 疱肉培养基
        • 特殊培养基
  • 细菌接种方法
    • 平板接种法
      • 用途：细菌分离和增菌
      • 平板划线接种法
        • 连续划线接种法：含菌量不多样本
        • 分区划线接种法：含菌量较多样本
        • 棋盘格划线接种法
      • 涂布接种法
      • 点种法
    • 斜面接种法
      • 用于鉴定和保存菌种
    • 半固体培养基接种法：培养基表面中心垂直刺入至底部上方3〜4mm 处,然后将接种针沿原路抽出
    • 液体培养基接种法
      • 可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验
  • 细菌培养方法
    • 温度：大多35~37℃
    • 时间：大多18~24小时
    • ph：大多7.2~7。6
    • 营养
    • 盐浓度
    • 气体
      • 需氧培养法：适合于需氧菌及兼性厌氧菌的培养
      • CO2培养法：5%~10%CO2
      • 微需氧培养法
      • 厌氧培养法
  • 细菌的生长现象
    • 固体培养基
      • 菌落(colony )：单个细菌分裂增殖成为一堆肉眼可见的细菌集团。
      • 光滑型菌落：即S型菌落; 粗糙型菌落：即R型菌落; 黏液性菌落：即M型菌落
      • 溶血特征
        • a溶血：又称草绿色溶血、甲型溶血或不完全溶血； β溶血:又称透明溶血、乙型溶血或安全溶血； y溶血:肉眼观察不到溶血
    • 液体培养基
      • 18-24小时 浑浊生长：大多数细菌 沉淀生长：少数链状排列的细菌 链球菌，炭疽芽孢杆菌 菌膜生长：专需厌氧菌 枯草芽孢杆菌 结核分枝杆菌 铜绿假单胞菌
    • 半固体培养基
      • 有动力的细菌：穿刺线周围均可见羽毛状、树根状或云雾状浑浊生长； 、 无动力的细菌仅在穿刺线上有生长
• 第三节细菌的生化反应检查法
  • 碳水化合物的代谢试验
    • 原理：细菌各自具有不同的酶系统,故对糖类的分解能力不尽相同。 有的能分解糖类产生酸和气， 有的分解糖产酸不产气 有的则根本不能分解。
    • 糖（醇、苷）类发酵试验
      • 原理：菌各自具有不同的酶系统,故对糖类的分解能力不尽相同。 培养基：液体、半固体或固体等几种类型的培养基 指示剂：酚红、漠麝香草酚蓝、 漠甲酚紫和酸性复红等 结果：产酸：培养基中指示剂酸性反应 产气：是培养基中倒管或半固体培养基出现气泡，固体培养基内有裂隙 不分解：培养基中除细菌生长外无变化 应用：糖（醇、苷）类发酵试验是很多细菌鉴定的重要实验，尤其是肠杆菌科菌鉴定
    • 克氏双糖琼脂（KIA）或三糖铁琼脂（TSI）试验
    • 氧化发酵（O-F）试验
      • 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中必须有氧气的参与，称为氧化型，能进行无氧降解 的为发酵型,不分解葡萄糖的为产碱型或不分解糖型。发酵型细菌在有氧无氧环境中都能分解葡萄糖,氧化型细菌只能在有氧环境中才能分解葡萄糖。 培养基：液体或半固体糖发酵管。 应用：主要用于肠杆菌科与非发酵菌的鉴别，肠杆菌科为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型;用于葡萄球菌属与微球菌属的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型。
    • 甲基红（MR）试验
      • 原理: 葡萄糖代谢生成丙酮酸，丙酮酸是糖酵解的关键性中间产物,从丙酮酸开始就有多种可供细菌遵循的途径。 某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸被代谢成为乳酸、醋酸、甲酸等。使培 养基的pH下降至4.5以下,加入甲基红指示剂出现红色为阳性反应;有些细菌分解葡萄糖 产酸量少,或产生的酸进一步转化为其他物质,培养基pH仍在6.2 以上，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。 培养基：培养基葡萄糖蛋白胨水培养基。
    • 伏普（Voges-Proskauer, V-P）试验
      • 伏普（Voges-Proskauer, V-P）试验 原理：葡萄糖代谢产生的中性最终产物乙酰甲基甲醇。一些细菌在分解葡萄糖代谢过程中产生的丙酮酸可进一步脱梭后生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被氧所氧化，生成二乙酰（丁二酮），与培养基内蛋白胨的精氨酸所含胍基发生反 应，生成红色化合物,即为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量较少,可加入少量含胍基的 化合物（如肌酸或肌酊等）。观察时加入a-萘酚可加速此反应。 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基 结果：数分钟出现红色，阳性 如无红色，且35℃4h后仍不变色为阴性 应用：常与甲基红试验一起使用，常用于肠杆菌科。一般情况下两者结果相反， 如大肠埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属等MR阳性,V・P则阴性，沙雷菌、产气肠杆菌、阴沟肠 杆菌V-P阳性,MR则阴性。
    • β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
      • 原理：细菌发酵乳糖过程中需要产生β-半乳糖苷酶-渗透酶和β-半乳糖苷酶，才能迅速发酵乳糖,有些细菌只有β-半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖。所有快速发酵 和迟缓发酵乳糖的细菌均可快速水解邻-硝基酚-D-吡喃半乳糖而生成黄色的邻-硝基酚 培养基：ONPG培养基 结果：黄色阳性，不变色阴性 应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，即鉴别乳糖延迟发酵菌与不发酵乳糖 菌
  • 氨基酸和蛋白质的代谢试验
    • 靛基质（吲哚）试验
      • 原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成红色吲哚 培养基：培养基蛋白胨水 结果：两层液体交界处出现红色为阳性,无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科鉴定（大肠埃希菌+，沙门菌-）
    • 硫化氢（H2S）试验
      • 原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S,H2S可与培养基中的铅离 子或二价铁离子生成黑色PbS或FeS 培养基：醋酸铅培养基 应用：主要用于肠杆菌科属与种的鉴别
    • 尿素酶试验
      • • 原理：有些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨，使培养基变成碱性，使含有酚红指示剂的培养基变成红色。 培养基：尿素培养基 结果：培养基变成碱性，酚红指示剂为阳性，不变阴性 应用：主要用于鉴别肠杆菌科中变形杆菌的鉴定。
    • 明胶液化试验
      • 原理：明胶（半固体）➡氨基酸（流动液体） 明胶≤20℃凝固，≥25℃融化 用途：肠杆菌科细菌鉴别，沙雷菌，普通变形杆菌，等可液化明胶，其他细菌很少液化 厌氧菌：产气荚膜梭菌，脆弱类杆菌也能液化明胶 多数假单胞菌也能液化明胶
  • 有机酸，盐和铵盐利用试验
    • 枸橼酸盐利用试验
      • 原理：枸橼酸盐在柠檬培养基上生长，分解柠檬酸盐，生成碳酸盐钠，是培养基变成碱性 培养基：枸橼酸盐培养基 应用：用于肠杆菌科中菌属和菌种鉴定 埃希菌属，志贺菌属，爱德华菌属，耶尔森菌属为阴性 沙门菌属，克雷伯菌属常为阴性
  • 酶类试验
    • 氧化酶试验
      • 原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素C氧化成氧化型的细胞色素C，再由氧化型的细胞色素C使得对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物 培养基：10g/l盐酸四甲基对苯二胺水溶液 用途：多种菌属和菌落的鉴定
    • 过氧化氢酶试验（触酶试验）
      • 原理：触酶能过催化过氧化氢分解生成水和氧气，从而产生气泡 培养基：新鲜配置的3%的过氧化氢水溶液 应用：于革兰阳性球菌及革兰阴性杆菌的初步分解
    • 硝酸盐还原试验
    • 血浆凝固酶试验
      • 原理：金黄色葡萄球菌可以产后凝固酶，使得血浆中的纤维蛋白转化为纤维蛋白原，产生凝固 方法：玻片法：取兔子血浆和盐水个一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分 别于血浆和盐水混合 试管法：取试管两支，各加入0.5ml的兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入血浆中并混匀，于37℃水浴3-4小时 结果：玻片法以血浆中有明显颗粒，而盐水中无自凝判为阳性，试管法以血浆凝固判为阳性 应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴定时常用的试验
  • 其他试验
    • CAMP 试验
      • 原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可以促进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌的交界处溶血能力增强，出现半月形的溶血区 培养基：血琼脂平板 方法：先以产β-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上 再将被检菌与前一划线做垂直划线接种，两线不能相交，相聚0.5-1cm，于37℃培养18-24小时，观察结果 结果：在两划线区出现箭头样的溶血区为阳性 应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。
    • 胆汁溶菌试验
      • 原理：胆汁或者胆盐可溶解肺炎链球菌，由于胆汁激活了自溶酶，加速了肺炎链球菌本身的自溶过程，使得肺炎链球菌溶解 试剂：10%去氧胆酸钠 应用：肺炎链球菌+ 甲型链球菌- 方法：平板法：取10%去氧胆酸钠一接种环，滴加于被测菌的菌落上，置35℃ 30分钟后观察结果 试管法：被检菌培养物两支，各0.9ml，分别加入10%去氧胆酸钠溶液和生理盐水（对照管）0.1ml，摇匀后置35℃水浴10-30分钟，观察结果 结果：试管法”加胆盐的培养物变透明，对照管仍浑浊“判为阳性 分支主平板法以”菌落消失“判为阳性
    • 杆菌肽试验
      • 原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他链球菌绝大多数对其耐药 培养基：血琼脂平板 方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍干后贴上0.04U片的杆菌肽纸片，35℃培养18-24小时观察结果 结果：抑菌环直径大于10mm为敏感，小于10mm为耐药 应用：用于A群链球菌和非A型链球菌的鉴别
    • 奥普托欣试验
      • 原理：几乎所有的肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试剂对其他链球菌则无抑制作用 培养基：血琼脂平板 方法：将待检菌落或者肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上稍干后贴含5微克每片的奥普托欣制片，35℃培养18-24小时观察结果 结果：抑菌环直径大于14mm为敏感，若抑菌环直径小于14mm对此菌株再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌 应用：主要用于肺炎链球菌于其他链球菌的鉴别
  • 综合实验
    • IMViC试验
      • I --- 吲哚试验 M---甲基红试验 V---伏普试验 C--枸橼酸盐利用试验 结果： 大肠埃希菌 ++-- 产气杆菌 --++
    • MIU复合试验
      • 动力 吲哚 脲酶 原理：具有色氨酸酶的细菌能分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚试剂变红色 具有脲酶的细菌能分解尿素产生氨，使得整个培养基变尖呈红色 有动力的细菌沿穿刺线生长 培养基：尿素，蛋白质的半固体 指示剂：酚红 方法：将大肠埃希菌和普通大肠杆菌穿刺线接种于MIU培养基，在35摄氏度，18-24小时，观察动力和脲酶反应，再滴加吲哚试剂 结果：扩散生长为动力阳性，滴加吲哚试剂以后呈玫瑰红色为阳性，
    • 克氏双糖铁（KIA-)或三糖铁（TSI）试验
      • 高层斜面培养基：葡萄糖：乳糖（蔗糖）=1：10 硫酸亚铁 指示剂：酚红 接种方法：先穿刺底层，再斜面上划线 结果：仅葡萄糖发酵：葡萄糖含量少，培养18-24小时后，斜面中的葡萄糖完全被利用，产生的酸因斜面处于氧分压高被还原，24小时后开始利用蛋白胨作为生长原料，蛋白胨分解产生氨呈碱性 乳糖和葡萄糖都发酵 乳糖和葡萄糖都不发酵 培养基中的含硫氨基酸在细菌半胱氨酸脱酶的作用下，产生硫化氢，与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁
• 第四节细菌的形态结构检查法
  • 显微镜检查
    • 普通光学显微镜：细菌染色标本的观察
    • 暗视野显微镜：暗视野显微镜可用于观察不染色样本活菌的形态和运动方式（了解
    • 相差显微镜：既能观察不染色细菌外形和运动方式，又能观察其内部某些细微结构和结构的数量
    • 荧光显微镜
    • 电子显微镜
  • 细菌的形态观察
    • 不染色检查法
      • 悬滴法：凹玻片
      • 压滴法：平玻片
      • 有动力：可以看到细菌从一处移至另一处，有明显的方向性位移 无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动，而无位置的改变，粗要注意的是细菌的运动和布朗运动 有些病原菌通过不染色标本的动力检查可做出初步的鉴定
    • 染色检查法
      • 常用染料：酸性染料；碱性染料；复合染料
      • 常用染色法
        • 单染色法；多染色法；特殊结构染色法；负染色法；荧光染色法
      • 鉴别染色法
        • 革兰染色法
        • 抗酸染色法
• 第五节细菌的血清学检验
  • 血清学鉴定
  • 血清学诊断
• 第六节细菌毒素的检测
  • 外毒素
    • 来源：革兰阳性菌与部分革兰阴性菌，大多活菌分泌 分类：神经毒素、细胞毒素和肠毒素类（具有选择性）
    • 肉毒毒素检测：动物中和试验
  • 内毒素
    • 内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖
    • 内毒素检测
      • 家兔热原实验(RT)
      • 鲎试验(LT)
• 第七节细菌数量的测定
  • 物理计数法
    • Breed计数法
      • 100mm2区域 0.01ml 涂 片 ，亚甲蓝染色油镜视野
      • 快速
      • 不能区分细菌的死活
    • 浊度法
      • 细菌悬浮液的浊度
      • 细菌不完全透光一定范围内菌溶液的浑浊度与细菌数量呈正比与Baso4系列标准比浊管比浊来确定相应的菌数
  • 生物技术法
    • 倾注平板法
    • 琼脂表面计数法
    • MPN法
      • 样品中细菌的分布不是随机的，均匀的，如果将样品分成很多份，分别接种至培养基中，则每个培养基中含有某特定数量的细菌的概率符合泊松分布 多次稀释，直至无菌
  • 微生物定量计数法
    • 直接
      • 显微镜计数法
      • 比浊法
    • 间接法
      • 倾注平板法
      • 表面涂布法
      • MPN法
      • 滤膜法
• 第八节细菌L型检验
  • 细菌细胞壁缺陷型，细菌细胞壁的肽聚糖结构受到物理、 化学或生物等因素的作用，直接破坏或合成被抑制，细胞壁受损的细菌在普通环境中因不能 耐受菌体内的高渗透压而胀裂死亡，但在
  • 是一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型细菌 已知几乎所有的细菌都可以形成细菌L型 有致病作用，与许多慢性反复发作的感染有关 高渗环境下仍可存活
  • 检验
    • 大多数不太稳定，可以通过在细胞培养基沙管转种，回复成普通细菌后进行鉴定 营养要求较高，培养基的成分应在脑心浸液或牛肉浸汤的基础上，另需加入10-20%的血浆（或者血清） 标本先用高渗肉汤增菌培养1-7天，在转种血平板和L型平板37℃培养2-7天 染色性发生改变，多为革兰阴性 形态发生改变，呈多形性，细胞壁染色可分辨细胞壁缺失情况 典型的菌落为荷包蛋样 患者标本中新分离的L型菌落常不典型，多呈现颗粒型菌落，涂片染色为多形性
• 第九节微生物菌种的保藏及保管
  • 注意事项
    • 按要求的温度存放 控制传代次数 用典型菌落传代，每次转种均划线分离 受损或衰老的细菌因恢复后保存 通过易感动物恢复固有特性 至少应该保存两套
  • 原理：选用优良的纯种，创造降低微生物生物代谢活动强度，生长繁殖受到抑制，难以发生突变的环境条件。 其环境要素是干燥，低温，缺氧，缺营养，添加保护剂等。
  • 菌种的分类
    • 一类:实验室感染的机会多,感染后发病的可能性大,症状重并能危及生命,缺乏有效的 预防方法,以及传染性强,鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌。 二类:实验室感染机会较多，感染后的症状较重甚至危及生命,发病后不易治疗及对人 群危害较大的传染病菌种;例如：布鲁菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌、结核分枝杆菌。 三类:仅具有一般危险性，能引起实验室感染的机会较少, 四类:生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种及不属于上述一、二、三类的各种 低致病性的微生物菌种。
  • 菌种的保藏方法
    • 定期传代保藏法
      • 固体：保存数周 半固体培养 ：保存数月 培养基加液体石蜡：保存一年
    • 低温或超低温保藏法
      • 含保护剂的菌液存放于-30℃、-70℃、-196℃保存数年
    • 冷冻真空干燥保藏法
      • 脱脂牛奶为保护剂，在冻结状态下真空干燥保存数年或者数十年
    • 液氮冷冻保藏法
  • 微生物菌种保藏机构
    • 中国微生物菌种保藏委员会 CCCCM 美国典型菌种保藏中心 ATCC 英国国家典型菌种保藏所 NCTC 法国巴斯德研究所菌种保藏中心 CIP
  • 各类细菌菌种的保藏
    • 专人保管，详细记录 保证安全，严守规定 定期接种，并作确认实验 运输与销毁严格执行相关规定