导图社区 生物选修3:基因工程
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英语词性
生物必修一
生物选修3:基因工程
DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶
来源:原核生物中提取
特性
特异性:是被双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列
使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
切割结果
粘性末端
平末端
DNA连接酶
E·coli DNA连接酶
来源:大肠杆菌
作用:只能连接粘性末端
T4DNA连接酶
来源:λ噬菌体
作用:既能连接粘性末端,又能连接平末端
载体
种类
常见:质粒(能够自我复制的双链环状DNA)
其他:λ噬菌体的衍生物,动植物病毒
条件
能在受体细胞中复制和稳定保存
具有一至多个纤至美求各位点,供外源DNA片段插入
具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择
基因工程基本操作程序
获取目的基因
从基因文库中获取
从部分基因文库(如cDNA文库)中获取[反转录法]
没有内含子、非编码区,也没有启动子
PCR(多聚酶链式反应)扩增
过程
(1)变性(高温解旋)
(2)退火(复性)
(3)延伸<Taq酶的最适温度>
*检测扩增结果:琼脂糖黏胶电泳
模板DNA
Taq酶
dNTP(提供原料和能量)
一对引物
设计原则
(1)长度【较长可以提高特异性】:15~30bp
(2)GC%:40%~60%,过低或过高都不利于引发反应,上下游引物差别不能太大
(3)Tm(双链DNA熔解温度,即DNA双链解旋到一半时的温度)
经验公式::Tm=4(G-C)+2(A-T),退火温度=Tm-5
套话:PCR扩增时,退火温度根据引物的长度、碱基组成来选择,引物CG含量越高,退火温度就越高;如果PCR退火温度过高会破坏引物与模板之间的碱基配对,导致反映得不到任何扩增产物
(4)5'端要求
5’端序列对PCR影响不大,因此常用来引进修饰位点或标记物
(5)避免引物自身或引物之间碱基配对
计算
(1)指数扩增:2^n
(2)
人工合成
基因较短,核苷酸序列已知
反转录法
mRNA---cDNA---目的基因
化学合成法
蛋白质序列---(推测)mRNA序列---(推测)DNA
构建表达载体
4+1
结构
启动子
(1)RNA聚合酶识别和结合的位点
(2)驱动基因转录出mRNA
插入基因:目的基因
终止子
使转录在需要的地方停下来
标记基因:筛选鉴定(也可以用萤光蛋白基因)
复制原点:复制从此开始,与启动子无关
功能
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代;使目的基因能够表达和发挥作用
将基因表达载体导入受体(核心步骤)
导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
对象
双子叶植物,裸子植物
*原理:Ti质粒的T-DNA转移至受体细胞,并正和岛受体细胞的染色体上
目的基因插入T-DNA序列---进入农杆菌---侵染植物细胞---目的基因整合到植物细胞染色体上---目的基因的遗传特性得意稳定维持和表达
(2)基因枪法
对象:单子叶植物
成本较高
(3)花粉管通道法
我国科学家独创
导入动物细胞
显微注射技术
目的基因表达载体提纯---取受精卵---显微注射---注射了目的基因的受精卵一直到雌性动物的子宫内发育---新性状动物
导入微生物细胞
微生物特点:繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少
方法:Ca离子转化法
钙离子处理细胞---感受态细胞---表达载体与感受态细胞混合---受体细胞吸收DNA分子
目的基因的检测和鉴定
Step1:检测转基因生物的染色体DNA上是否插入目的基因
DNA分子杂交技术(提取DNA做基因探针)
Step2:检测目的基因是否转录出mRNA
DNA分子杂交技术(提取mRNA做基因探针)
Step3:检测目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交技术(所用的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应抗体,并提取而来的)
个体生物学水平鉴定
蛋白质工程
流程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的核糖核苷酸序列(RNA)→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列(DNA)
与基因工程的区别
基因工程
获取目的基因---构建表达载体---导入受体细胞---目的基因的鉴别与鉴定
实质
定向改造人类所需的脱氧核苷酸
定向改造生物的遗传特征,以人类所需要的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果
产生自然界没有的蛋白质
产生自然界已有的蛋白质
现状
集中在改造现有的蛋白质,对创造新的蛋白质目前还没有成功的例子,原因是蛋白质的高级结构非常复杂
已经广泛应用,转基因植物、动物、生产药品等已商业化,但基因治疗仅处于试验阶段,为实践应用
联系
蛋白质工程是基因工程基础上延伸出来的的二代基因工程
基因工程应用
植物基因工程
抗病转基因植物
抗逆转基因植物
抗虫转基因植物
转基因改良职务品质
动物基因工程
提高动物的生长速度
改善畜产品品质
抓安基因动物生产药物
基因来源
成果:乳腺生物反应器
转机移动无座器官移植的供体
基因工程药物
来源:转基因微生物
成果:人胰岛素、细胞因子、抗体、疫苗、激素等
基因治疗
基因武器的危害性