导图社区 单克隆抗体制备(1)
单克隆抗体，简单介绍了其概念，和重点介绍了制备流程，仅供大家参考，如有问题可以互相交谈，谢谢。
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单克隆抗体制备
概念
单价抗原
单种B细胞
单种抗体
制备流程
动物免疫
动物选择
采用与骨髓瘤系来源相同的动物
免疫方案
免疫周期、免疫试剂，免疫动物，免疫次数
骨髓瘤细胞的培养
选择要求
来源与免疫小鼠同一品系，组织相容性抗原一-致;
次黄嘌呤_乌嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷株 或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)缺陷的细胞株;
与B细胞杂交形成稳定杂交瘤细胞，分泌Ig;
本身不分泌Ig;
生长速度快，繁殖时间短。
培养关键
融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证细胞处于对数生长期
定期用8-氮杂鸟嘌呤(8~AG) 筛选HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞
避免微生物污染及细胞返祖，不宜长期传代培养;
必要时可采用活体内生长的骨髓瘤细胞进行融合。
饲养细胞制备
作用机制
释放若干非种属特异性的生长刺激因子，为其他细胞提供必要生长条件
满足新生杂交瘤细胞对细胞浓度的依赖性
细胞融合
免疫脾细胞的制备
对免疫后小鼠进行血清效价测定
取出小鼠脾脏
制备脾细胞悬液
B细胞与骨髓瘤细胞进行融合
关键
细胞的比例和细胞的活性
PEG的分子的量和浓度
PEG反应时间和操作手法
子主题
无菌操作
结果
HAT选择培养
原理
根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径来设计
存活情况
杂交瘤细胞生长繁殖
骨髓瘤无法合成核酸死亡
免疫B细胞体外无法增殖死亡
阳性杂交瘤细胞的筛选
筛选要求
杂交瘤细胞布满孔底1/10时开始筛选
筛选方法须在融合前建立
筛选方法
要求
多——大量样品一次检测
快——迅速取得检测结果
准——检测结果可靠性高
灵——检测方法灵敏度高
间接ELISA法
筛选步骤
显微镜观察确定待筛选孔
换液，培养2天以上
取100μl上清用于检测
克隆化培养
筛选
第一次克隆，筛选ELISA阳性，进行第二次筛选，筛选ELISA阳性，然后进行第三次筛选，建系，扩大培养
筛选出的细胞系，在克隆化过程中，须有两次阳性检测100%
( 1)及时克隆;
(2)第一次克隆化使用HT培养液;
( 3)克隆化时需加饲养细胞;
( 4)克隆化时可设置不同细胞密度;
(5)克隆化至少3次以上，且单克隆孔的检测阳性率达100%为止，并及时冻存阳性亚克隆。
方法
有限稀释法
取100个细胞，经过三次稀释，分别为10³/ml,10²/ml,10/ml,然后加到96孔计数板
取100个细胞，稀释成三个浓度，分别为20/ ml,10/ ml,5/ ml,然后加到96孔计数板各个浓度占相同比例
软琼脂法
单细胞显微操作法
流式细胞仪分选法
建系、扩大培养、冻存
建系
每次克隆化筛选的阳性细胞
冻存的关键
冻存液4°C预冷;
选择对数生长期的杂交瘤细胞冻存，操作轻柔、迅速;
每支冻存管内冻存的细胞液体量不要超过1ml，避免因液体溢出造成污染;
冻存的杂交瘤细胞应保留5-10只不同批次和日期的冻存管，定期复苏，检查细胞活性和分泌抗体的稳定性。
单克隆抗体大量制备，纯化，鉴定
大量制备的两种方法
体外培养法
体内诱生法
实体瘤诱生法
腹水诱生法
纯化
盐析法和层析法
腹水预处理→辛酸-硫酸铵法→离子交换层析法、亲和层析法、凝胶过滤法
抗体效价鉴定
交叉反应实验，单抗的类、亚类测定实验（胶体金纸条法，双向琼脂扩散法，ELISA法）
