导图社区 基因工程的酶学基础
关于基因工程的酶学基础的思维导图，内容有 R/MT体系、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶，快来看看吧！
这是一个关于微生物的思维导图，概述了微生物的多个方面，包括其分类、特性、历史发现、与人类的关系以及微生物学的基本操作技术等。
这是一个关于基因工程的酶学基础的思维导图，主要涉及一系列酶在DNA分子操作中的应用。基因工程的酶学基础是建立在一系列酶的应用之上的。这些酶通过识别、切割、连接等操作，实现了对DNA分子的精确改造和重组。
基因工程的酶学基础，内容有 R/MT体系、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶，欢迎大家学习。
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基因工程的酶学基础
R/MT体系
限制：通过限制性核酸内切酶在特异性位点切割入侵的外源DNA
修饰：为了防止自身的DNA免受自身的限制性核酸内切酶的切割，对特异性位点进行甲基化修饰 这种限制性核酸内切酶及其相应的甲基化酶为限制-修饰体系
作用：保护自身DNA不受限制；破坏外源DNA市值迅速降解
细菌正是利用这种限制修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的
限制性核酸内切酶
概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶
仅切割DNA双链，而不切割单链DNA；仅切割磷酸二脂键，并不破坏含氮碱基
类型
I型：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体，它在识别位点很远的地方任意切割DNA链
II型：识别和切割双链DNA分子的特定核苷酸序列
II型内切酶识别位点
1）一般识别序列为4-8bp，大部分为旋转对称型回文结构
回文结构: 双链DNA或RNA分子中的特定的核首酸片段，该片段在其中一条链上按5’到3‘读取的序列与其互补链上按相同的5’到3‘读取的序列一致
2）有时可识别内部简并或外部简并的序列
3）同裂酶：来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶.
4）同尾酶：来源不同，识别序列也各不相同，但能产生出相同的粘性末端的一组酶。
II型内切酶的切割方式及意义
1）三种切割方式
从识别序列中间切开产生平未端
从5-3链上对称轴左方切开和3-5链上对称轴右方切开形成具有凸出的5’磷酸基团的粘性末端
粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来
意义
用相同内切酶切割后的片段能在5端靠碱基配对将单链重叠成双 链
促使不同的DNA分子相连
使一个DNA片段首尾相连而自身环化,
从5’-3链上对称轴右方切开和3-5链上对称轴左方切开形成具有凸出的3”轻基基团的粘性末端
III型：也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列 ;它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。
II型内切酶酶解反应中的注意事项
酶从冰箱中取出后,应置于冰中；避免反复冻融；反应中尽可能少加水，使反应体积减到最小。酶体积不超过反应总体积的1/10( 甘油)。
影响内切酶活性的因素
DNA纯度
DNA制剂中，蛋白.酚，氯仿，酒精，EDTA高盐浓度等，影响RE的活性。
提高酶切效率方法:1.增加RE用量 2.扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释 3.延长酶切时间
DNA甲基化程度 甲基化作用会强烈影响酶活性。基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的
DNA分子结构 超螺旋比线性DNA需酶量大; DNA 的边序列也有影响注意识别序列两侧必须有侧翼序列，限制性核酸内切酶才能对其进行切割
酶切反应温度 一般37
RE缓冲液
星号活性: 非最适条件( 酶量大，甘油高、低离子强度高pH等)常使酶发生不正确切割( 切割特异性序列相似的序列 )
导致星号活性的因素： 较高的甘油浓度 (>5% v/v) ； 酶与底物DNA比例过高(不同的酶情况不同，通常为>100 U/ug； 低盐浓度 (<25 mM)； 高pH值 (>pH 8.0) 存在有机剂(如DMSO、乙醇等) 用其他二价离子替代镁离子(如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等)
完全酶切消化：如果一种RE对某个DNA分子的所有识别位点均实现了完全的切割称为完全酶切消化
限制性内切酶的不完全消化：RE对DNA分子的消化不完全，即未能在所有分子的所有识别位点进行完全的切割，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物
DNA连接酶
DNA连接酶是一种能够催化DNA上切口两侧(相邻)核首酸裸露的3’轻基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酷键，使原来断开的DNA裂口重新连接起来的酶。参与DNA复制、损伤DNA修复及DNA重组
分类
大肠杆菌DNA连接酶( NAD )
T4 噬菌体DNA连接酶( ATP )
真核生物DNA连接酶( ATP ) DNA连接酶I；DNA连接酶III；DNA连接酶IV
大肠杆菌DNA连接酶
可连接：两个带有互补黏性未端的双链DNA 分子； 一条链带有切口的双链DNA 分子 正常情况下不能连接平末端
分子量68kDa,需ATP作辅酶因子
T4 菌体DNA 连接酶可以连接 1）两个带有互补黏性末端的双链DNA 分子 2）两个带有平头末端的双链DNA 分子 3) 一条链带有切口的双链DNA 分子 4）RNA:DNA 杂交双链上的DNA链上的切口或RNA 链上的切口
使用DNA连接酶时的注意事项
可连接切口(nick )，但不可连接缺口(gap)； 可连接双链DNA分子的一部分，但不可连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA 分子
影响连接反应的因素
温度；DNA连接酶浓度；载体片段比；镁离子，ATP
如何连接不同类型的DNA片段
粘性末端DNA片段的连接
互补粘性末端的连接
Ecoli DNA 连接酶及T4 DNA连接酶均能进行连接
同种内切酶黏性未端间的连接( 单酶切/同尾酶粘性末端连接
不同内切酶粘性未端间的连接( 双酶切片段的连接
单酶切粘性末端连接
优点 : 操作简单，并且易于回收外源DNA片段
不足之处 : 载体易发生自连 不易定向克隆 大片段重组率低 重组体类型多，筛选难度大
解决方法: 采用碱性磷酸酶CIP或BAP处理其中一种片段，去除5-P基团，避免片段的自身连接
碱性磷酸酶的特性: 催化核酸分子脱掉5’磷酸集团，从而使DNA(或RNA ) 片段的5-P末端转换成5-OH末端，即核酸分子的脱磷酸作用。
BAP(细菌碱性磷酸酶)，是从大肠杆菌中纯化出来的，具有抗热性
CIP(小牛肠碱性磷酸酶)，是从小牛肠中纯化出来的，SDS中加热68°C可完全失活。
碱性磷酸酶处理：经碱性磷酸酶处理的质粒线性DNA分子失去了自身环化能力，但仍能与具5-P和3-OH的外源DNA片段重组，并在转化到受体细胞后完成Nick的修复工作。
非互补粘性末端的连接
无法直接进行连接 策略: 把粘性未端改成平末端( 增加或减少几个碱基，破坏原来的酶切位点 )
补平 : 不具有5-3外切活性的DNA聚合酶，如Klenow fragment ofE.coli DNA polymerase I( 仅适用于5粘性未端 )
削平:外切核酸酶VII或S1核酸酶把非互补的粘性末端转变成平末端后可以采用T4 DNA连接酶进行连接
平末端DNA片段的连接
直接采用T4 DNA连接酶进行连接
措施：增加T4DNA连接酶浓度；增加平末端DNA的浓度；选择合适的反应温度；向反应体系中加入适量的一价阳离子 ( 150 mmol/L NaCL ) 和低浓度的聚乙二醇
同聚物加尾（末端转移酶）
原理
能够将核首酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上，而且不需要模板的存在。当反应物中只存在一种脱氧核首酸的条件下，便能够构成由同一种核首酸组成的尾巴，可长达100个核首酸左右
适用范围 ： 酶切后形成的平齐末端 机械切割大分子DNA产生平齐末端 RNA模板制备的CDNA具有平齐未端
衔接物(linker)连接法
DNA连杆/衔接物: 用化学法合成的一段由10 ~ 12个核酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的寡核首酸片段
DNA接头连接法
DNA接头: 是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性未端另一头为平末端的特殊的双链寡核首酸短片段
DNA聚合酶
概念
是一种辅助DNA复制的酶，该酶是以DNA为复制模板，在具备模板、引物、dNTP等的情况下，将DNA由5”端开始复制到3’端的酶。
常用的DNA聚合酶
大肠菌DNA聚合酶I( 全酶 )
大肠杆菌DNA聚合酶工的Klenow大片断酶
T4DNA聚合酶
T7DNA聚合酶
反转录酶等
常用的DNA聚合酶的特征和功能
大肠杆菌DNA聚合酶
大肠杆菌中分离纯化了5种不同类型的DNA聚合酶，包括DNA聚合酶l，Il，Ill，分别简称为Poll，PolIl Pol lll
广泛用于基因工程操作的主要是Pol1
PolI发挥作用的条件
底物:全部四种脱氧核首5 三磷酸dNTPs
镁离子
带有3-OH游离集团的引物链
DNA模板 :单链，双链(糖磷酸主链上有一至数个断裂 )
具有三种酶的催化活性
5’-3’的聚合酶活性: DNA链的合成是按5-3方向
5’-3的外切酶活性: 从游离的5’-P末端水解DNA分子，释放出5’-单核首酸或寡核酸
3’-5’的外切酶活性( 较低) : 从DNA链3-OH末端开始向5的方向水解DNA，并释放出单核昔酸分子
DNA切口转移( nick translation ) 和DNA杂交探针的制备
在DNA分子的单链切口上，DNA聚合酶工的5-3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从切口的5’一侧移去一个5'核音酸之后，聚合酶作用就会在切口的3’一侧补上-个新的核首酸，但pol工 不能在3’-OH和5-P之间形成一个键随着5’一侧的核音酸不断移去 ，3’一侧的核首酸又按序列增补切口便沿着DNA分子合成的方向移动
通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。
Klenow片段
是由大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76*103dal的大片断分子。仍具有5’-3’的聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性，失去了全酶的5’-3’外切酶活性
用途
补平经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽未端
标记DNA片段的未端;
CDNA克隆的第二链CDNA的合成;
应用双脱氧链未端终止法进行DNA测序
pol II
参与DNA损伤的应急修复状态
pol III
是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶
T4 DNA聚合酶
从T4菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶
具有5'->3'DNA聚合酶活性及3'->5'外切酶活性，不具有5->3外切酶活性
在没有脱氧核首三磷酸存在的情况下，3’外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核首酸时就会停止.
反转录酶
依赖于RNA的DNA聚合酶也叫做RNA指导的DNA聚合酶或反转录酶 。即以RNA为模板催化脱氧核首酸合成互补DNA的酶。
具有RNA指导的DNA聚合酶活性( 可以将单链RNA反转录为DNA )
RNaseH活性 ( 降解DNA-RNA杂交链中的RNA链)
DNA指导的DNA聚合酶活性(以合成的第一条DNA链为模板合成第二条DNA链)
感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶
具有5-3的聚合酶活性( 大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成）和很高的单链及双链的3’-5核酸外切酶活性。
修饰的T7DNA聚合酶
对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’-5”的外切酶活性聚合作用的速率增加了3倍
DNA修饰酶
末端转移酶
来源
是从小牛胸腺中分离纯化出的一种小分子量( 34*103 dal) 的碱性蛋白质
功能
催化5脱氧核昔酸进行5’-3”的聚合作用
反应中不需要模板
是一种非特异性的酶
同聚物加尾。
平未端片段的连接-同聚物加尾
T4多核苷酸激酶
是由T4菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初是从T4菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来，后来在多种哺乳动物细胞中也发现这种酶
当具有5-OH的单链、双链DNA、RNA或寡聚核酸链+ATP存在时，可以将ATP的v-磷酸基团转移到5’-OH，使后者磷酸化( 正向反应) ;
当上述核昔酸链的5’-P + ADP存在时，可以将核酸链的5-P转移到ATP上( 交换反应 )
DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端
碱性磷酸酶
种类
BAP(细菌碱性磷酸酶)，是从大肠杆菌中纯化出来的，具 有抗热性
CIP( 小牛肠碱性磷酸酶)，是从小牛肠中纯化出来的SDS中加热68°c可完全失活
