第九章 植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立

超低温保存(cryopreservation)是指建立在离体培养技术基础上，在 −196~−80°C， 甚至更低温度环境条件中保存生物或种质资源的一套生物学技术。

第九章 植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立

• 第一节 植物细胞培养物超低温保存的概念与原理
  • 一、超低温保存的概念
    • 超低温保存(cryopreservation)是指建立在离体培养技术基础上，在 −196~−80°C， 甚至更低温度环境条件中保存生物或种质资源的一套生物学技术。超低温保存常用的冷 源有干冰(−79°C)、深冷冰箱、液氮(−196°C)。又因液氮为最常用的冷源，所以超低温 保存又称为液氮保存。
  • 二、超低温保存的原理
    • 在有或没有冷冻保护剂存在的条件下，超低温处理植物材料，可以使植物细胞和组 织培养物内的物质代谢和生长活动大大减慢，甚至几乎完全停止，植物处于无分裂或零 代谢的相对稳定的生物学状态，保持生物材料的稳定性，减少遗传变异的发生，因而可 以长期保存种质。
  • 三、超低温保存的作用与意义
    • 1.保持细胞培养物的遗传稳定性 细胞培养物不断继代培养易使染色体和基因发 生变异，如产生多倍体、非整倍体及染色体易位等。这些变化可能会导致细胞失去形态 发生的潜能，或使一些具有特殊产物和具有抗逆性的细胞系在继代过程中丢失重要的性 状。研究已表明，在液氮等条件下的超低温保存，细胞培养物能长期保持形态发生的潜 能和遗传性状的稳定性。
    • 2.植物种质资源的长期保存 建立长期保存植物种质资源库来保存天然植物种 质资源，尤其是那些稀有、珍贵和濒危植物资源十分必要。细胞培养物在超低温保存后， 能再生完整的新植株，而且通过组织培养可以大量繁殖，可节省种子保存过程中资金的 耗费，为植物种质资源的长期保存提供了一条可行而又理想的途径。
    • 3.农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存 种子低温保存是防止良种衰变 的一个重要途径，但需要大规模基本建设，耗资较多。体细胞培养物超低温保存，体积 小、繁殖速度快，是农作物优良品种及亲本种质长期保存的比较经济有效的途径。例如， 建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不但可以防止种质的遗传变异和退化， 而且可以长期保存无病毒的原种。
• 第二节 超低温保存的基本程序与方法
  • 一、超低温保存的基本程序
    • 超低温保存的基本程序包括植物材料或培养物的选取、冻存前对植物材料脱水处理、 冷冻处理、冷冻保存、化冻和恢复生长再培养、生活力及冷冻危害的测定等。
  • 二、超低温保存的方法与技术
    • (一)植物材料的选取
    • (二)植物材料的预处理
      • 1.加入冷冻保护剂
      • 2.低温锻炼
    • (三)冷冻方法
      • 1.慢冻法
      • 2.快冻法
      • 3.玻璃化法
      • 4.干冻法
      • 5.包裹脱水法
      • 6.包裹玻璃化法
    • (四)冻藏
    • (五)化冻与洗涤
    • (六)再培养
  • 三、超低温保存后存活材料的评价
    • (一)存活率的快速鉴定
    • (二)细胞结构和遗传稳定性的鉴定