体外DNA重组

大学生专属-基因工程教材思维导图整理，内容包含 受体细胞、DNA的酶切与体外连接、重组体导入细菌细胞，有兴趣的可以看看哟。

体外DNA重组

• 受体细胞
  • 基本条件
    • 便于重组DNA分子的导入
      • DNA分子能稳定存在
        • 安全性高无污染
    • 便于筛选重组体
      • 遗传稳定性高
        • 便于真核目的基因的高效表达
  • 常用受体细胞
    • 原核细胞
      • 优点
        • 无纤维素壁便于导入，染色体裸露便于重组，基因组简单便于比对，单细胞培养简单
      • 缺点
        • 不具备蛋白质折叠复性系统，缺乏蛋白质加工修饰系统，表达产物不稳定
      • 常用细胞
        • 大肠杆菌
        • 枯草杆菌
        • 蓝细菌
    • 真菌细胞
      • 优点
        • 表达调控机理清楚，具有蛋白质后修饰加工系统，不产生毒素
        • 大规模发酵工艺简单，产物可分泌至培养基
      • 常用细胞
        • 酵母菌
    • 植物细胞
      • 优点
        • 愈伤组织能直接再生新植株
      • 缺点
        • 大多数单子叶植物的原生质体很难再生
    • 动物细胞
      • 优点
        • 能识别并除去内含子，产物具有较好的免疫原性，易被质粒转染，遗传稳定可重复
      • 缺点
        • 技术要求高
• DNA的酶切与体外连接
  • DNA的片段化——酶切
    • 限制性内切酶
    • 标准酶切反应
    • 酶切注意事项：取出后冰上保存，DNA应具备一定的纯度，反应缓冲液种类应相同
  • DNA分子的体外连接
    • 粘性末端的连接
      • DNA与DNA之间
      • DNA片段与载体之间
    • 齐平末端的连接
      • 直接连接
      • 人工加尾形成“粘性末端”
        • 加尾连接
        • 衔接物“linker”
        • DNA接头（adapter）连接法
    • PCR产物的连接
      • 与T载体直接连接
      • 在引物的5'端设计酶切位点
    • 需要注意的事项
      • 插入片段与载体的酶切位点互补
      • DNA插入的方向正确
      • 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
      • 防止载体自身环化连接
• 重组体导入细菌细胞
  • 感受态大肠杆菌的制备
    • 目的：增加受体菌细胞膜的通透性
    • 菌种：丧失了限制-修饰体系统的大肠杆菌
    • 制备原理：Cacl2可增加通透性
    • 制备过程
  • 重组DNA导入大肠杆菌
    • 方法
      • 转化：大肠杆菌捕获质粒DNA的过程 转染：大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程
    • 转化率：每微克DNA转化成功的细菌克隆数
    • 转化方法
      • 热休克法
      • 电转化法
    • 平板培养基培养细菌
    • 影响转化率的因素
      • 重组质粒
      • 感受态细胞
  • 外源基因导入真核细胞
    • 导入酵母细胞
      • 菌株选择
      • 酵母的转化方法
        • 利用原生质体进行转化
        • 利用Li+盐进行转化
        • 电转化法
    • 导入植物细胞
      • 叶盘法
      • 电击法
      • 基因枪法
      • 农杆菌介导法
    • 导入哺乳动物细胞
      • 脂质体介导法
      • 显微注射法
      • 电融合法
  • 重组子的筛选
    • β-半乳糖苷酶显色反应选择法（蓝白斑筛选）
    • 利用外源基因表达产物特性进行直接选择
    • DNA电泳检测法
      • 直接电泳检测法
      • 酶切电泳筛选法
      • PCR扩增检测法
    • 核酸杂交检测法
      • 原位杂交筛选
      • R-环检测法