高校液相色谱法

高效液相色谱法HPLC思维导图，在经典液相柱色谱基础上引入GC的理论和技术,用高压泵输送流动相, 采用高效固定相及高灵敏检测器发展而来的分离分析方法。

高效液相色谱法HPLC

• 概念
  • 在经典液相柱色谱基础上引入GC的理论和技术,用高压泵输送流动相, 采用高效固定相及高灵敏检测器发展而来的分离分析方法
• 特点
  • 与经典色谱方法相比——高效、高速、高灵敏度
  • 与GC相比——GC需要加温操作；HPLC室温操作、高压
• 高效液相色谱仪
  • 高压输液系统
    • 流动相储存器（贮液瓶）
      • 流动相使用之前要经过过滤和脱气处理
        • 过滤——除去流动相中的机械杂质
        • 脱气——去溶解在流动相中的气体
          • 超声脱气最常用
    • 高压输液泵
      • 基本要求——流量稳定、流量范围宽、耐高压、耐腐蚀和适用 于梯度洗脱
      • 分类
        • 恒流泵
          • 柱塞往复泵最常用
        • 恒压泵
      • 双泵系统——克服单泵的脉动性
    • 梯度洗脱装置
      • 等度洗脱
      • 梯度洗脱
        • -
          • 线性梯度
          • 阶梯梯度
        • -
          • 高压梯度洗脱
            • 优点——通过梯度程序控制器控制每个泵的输出, 能获得任意形式的梯度曲 线, 精度高
            • 缺点——必须使用两个以上的高压输液泵,；仪器造价高
          • 低压梯度洗脱
            • 优点——只需要一个高压输液泵, 由计算机控制比例阀改变溶剂的比例。
            • 缺点——易产生气泡, 需在线脱气装置。
  • 进样系统
    • 六通进样阀
      • 进样重现性好, 耐高压；进样体积10~20 μl
    • 自动进样器
  • 色谱分离系统
    • 组成
      • 保护柱(预柱)
      • 色谱柱
      • 恒温装置(柱温箱)
    • 评价样品
      • 硅胶柱——苯、奈、联苯及菲
      • 烷基键合相柱——苯、奈、联苯及菲
  • 检测系统
    • 检测器
      • 通用型
        • 蒸发光散射检测器ELSD
          • 散射光强度正比组分的量
        • 示差折光检测器
      • 选择型
        • 紫外检测器UVD
          • HPLC中应用最普遍的检测器
          • 特点
            • 优——灵敏度高、线性范围宽、不破坏样品、对温度及流速波动不敏感
            • 缺——不适用对紫外光无吸收的样品, 流动相的截止波长必须小于检测波长
          • 分类
            • 可变波长检测器
              • 氘灯为光源；选择组分的最大吸收波长为检测波长, 以提高检测灵敏度
            • 光电二极管阵列检测器
        • 荧光检测器FLD
  • 数据记录与处理系统
    • 分析流程
      • 贮液瓶流动相经混合室混合, 被泵吸入, 导入进样器。样品用注射器注入, 随流动相通过色谱柱进行分离, 然后进入检测器, 检测信号经过数据记录与处理系统处理, 记录色谱图
  • 辅助装置
    • 梯度洗脱
      • 在分离过程中，按一定程序改变流动相的配比，使溶剂极性、离子强度或pH改变，从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩短分析时间，提高分离效率
        • 低压梯度洗脱（外）
        • 高压梯度洗脱（内）
• 主要类型及其分离原理
  • 分类
    • 吸附色谱法（液-固吸附色谱固定相）
    • 液-液分配色谱法
      • 基本原理——组分在固定相和流动相中溶解度不同而分离;
      • 固定相
        • 化学键合相
          • 优点——固定相的均一性和稳定性好, 在使用过程中不易流失, 使用周期长; 柱效高; 重现性好; 能使用的流动相和键合相的种类多, 分离的选择性高
      • 分类
        • 正相分配色谱
          • 固定相
          • 流动相
          • 适用范围
          • 分离选择性
        • 反相分配色谱
          • 固定相
          • 流动相
          • 适用范围
          • 分离机制——疏水剂作用理论
    • 离子交换色谱法
      • 适用对象——氨基酸、肽和蛋白质
    • 分子排阻色谱法
    • 离子色谱法
      • 抑制型离子色谱法
      • 非抑制型离子色谱法
    • 离子对色谱法
      • 分类
        • 正相离子对色谱
        • 反相离子对色谱
      • 常用离子对试剂
        • 阴离子分离——常采用烷基胺类
        • 阳离子分离——常采用烷基磺酸类
• 固定相和流动相
  • 固定相
    • 分类
      • 硅胶
        • 分类
          • 半硬质凝胶
          • 硬质凝胶
          • 凝胶特性参数
      • 化学键合相：用化学反应的方法将官能团键合在载体表面上所形成的填料
        • 优点
          • 使用过程中无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性和使用寿命
          • 化学性能稳定
          • 传质过程快,柱效高
          • 适于梯度洗脱
        • 分类
          • -
            • 非极性键合相
            • 中等极性键合相
            • 极性键合相
            • 离子交换键合相
        • 封尾——在键合反应后, 用三甲基氯硅烷等进行钝化处理
      • 凝胶
  • 流动相
    • 选择
      • 液-固吸附色谱流动相
      • 液-液吸附色谱流动相【要求流动相与固定相的极性有显著不同，以防固体液流出】
        • 正相
          • 常的选用弱极性溶剂；极性小的先流出
        • 反相
          • 流动相主体为水
    • 依据
      • 溶剂的极性是重要的依据
• 分离操作条件选择
  • A
  • B/u
  • Cu
  • H=A+Cu