药物毒理学

《药物毒理学》第1，2，14，16，17，18，19，21章内容，由于是选修课，没有做全书的思维导图，重点是新药开发非临床（即临床前）安全性评价的内容，包括急性毒性研究、长期毒性研究、一般药理学研究、特殊毒性研究（遗传毒性、致癌、生殖毒性、药物依赖性）、注射制剂的毒性研究（血管ciji性、过敏性、体外溶血试验、热原试验），局部用药制剂的毒性研究等。

总论

• 相关名词解释
  • 标记的可能会考
  • 毒性toxicity、暴露exposure、靶部位、靶组织、靶器官、剂量dose、效应、反应、剂量－反应关系、and so on
  • 量反应（graded response ）
    • 毒性反应强弱呈连续增减的量变
  • 质反应（quantal response ）
    • 毒性反应只能用全或无、阴性或阳性表示
  • 毒性常用表示指标
    • NOAEL
      • 未观察到损害作用的剂量（ No-Observed Adverse Effect Level）：指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量
    • LD50
      • 半数致死量：能引起半数实验动物死亡的浓度或剂量
    • MTD
      • 最大耐受量（maximal tolerance dose）：机体能耐受的最大剂量
    • 最小中毒量
    • 最小致死剂量LD01
      • 引起实验动物出现死亡的最低剂量
    • 治疗指数TI
      • 半数致死量与半数有效量（ median Effect Dose，ED 50 ）的比值，即TI = LD 50 / ED 50
    • 安全范围MOS
      • （Margin Of Safety, MOS ）：单次给药后ED 99 ~ LD 01的距离（或ED 95 ~ LD 05 ）
• 毒性作用类别
  • 毒性反应
    • 剂量相关性
    • 剂量过大或药物在体内蓄积过多时对机体的脏器或组织发生的危害性反应
  • 变态反应
    • 非肽类药物作为半抗原与机体蛋白结合后（D+P=DP），经过敏感化过程而发生的反应
  • 特异质反应
  • 致突变与遗传毒性
    • mutagenesis and genetic toxicity：药物损伤人类或哺乳动物的遗传物质而发生突变作用，从而产生对人类本身和后代的影响
  • 生殖毒性和发育毒性
    • reproductive and developmental toxicity：用药后对生殖系统、生育、胚胎产生与发育的影响，表现为不育、流产、死胎、结构畸形和功能异常
  • 致癌性
  • 其他（非并列关系）
    • 不良反应
    • 副反应
    • 可逆反应
      • 药物的毒性作用在停药或减量后可逐渐消失
        • 如大多数肝损伤和刺激性
    • 不可逆反应
      • 毒性作用一旦出现，不可逆转
        • 如神经系统损伤、腐蚀性以及大多数心脏毒性作用
    • 全身毒性
      • 药物被吸收进入循环分布于全身而产生的毒性反应
    • 局部毒性
      • 药物仅在接触的局部产生的毒性反应
• 药物毒性作用机制
  • 发展
    • 终毒物从给药部位到靶组织
    • 终毒物与靶分子的反应
      • 毒性反应类型
        • 非共价键结合
        • 共价键结合
        • 氢键吸引
        • 电子转移
        • 酶反应
      • 靶分子的毒效应
        • 靶分子功能障碍
        • 靶分子结构改变
        • 新抗原形成
    • 细胞功能紊乱导致的毒性
      • 细胞调节紊乱
        • 基因表达失调
          • 转录失调
          • 信号转导失调
          • 信号产生失调
        • 细胞活性失调
          • 电兴奋细胞活动失调，如神经细胞，骨骼肌，心肌，平滑肌
            • 神经递质水平改变：药物使得神经递质合成、存储、释放三个方面改变
            • 药物-神经递质受体相互作用（包括直接激动拮抗受体，或间接激活抑制递质分解酶等）
            • 药物-信号传导相互作用：药物作用于电兴奋传导相关离子通道等
            • 药物-信号终端相互作用
          • 外分泌细胞分泌异常等
      • 细胞维持的毒性改变
        • 还有一点没搞完
        • 细胞内稳态损伤
        • 细胞外稳态损伤
    • 修复或错误修复
      • 分子修复
        • 蛋白修复：蛋白二硫键化合物可以被酶还原逆转
        • 脂质修复：磷脂酶A2水解过氧化脂肪酸为正常脂肪酸
        • DNA修复：
          • 直接修复：烷基转移直接去除加成物
          • 切除修复：酶切碱基、核苷酸
          • 重组修复（SCE）
      • 细胞修复（外周神经）？？
      • 组织修复
    • 修复不全导致的毒性
      • 组织坏死
      • 纤维症
        • 细胞损伤激发大量 细胞增生 和 细胞外基质 生成。细胞外基质生成如果没有终止，就发展为纤维症。是一种以异常组分在细胞外过度沉积为特征的病理状态。
      • 致癌
        • DNA修复失败
        • 凋亡失败
        • 细胞增殖终止失败
• 新药开发流程
  • 发现毒理学研究
    • 培养细胞（动物细胞、人体细胞、基因重组细胞）
    • 培养组织（动物及人体组织）
    • 少量动物的体内评价法
  • 新药临床前安全性评价
  • 临床安全性评价
    • I期：探索安全的人用剂量
    • II期：疗效、不良反应
    • III期：大样本观察
    • Ⅳ期：流行病学研究
      • ADR (adverse drug reaction)
      • 合理用药
• 研究方法
  • 主要是借助于动物模型模拟引起人体中毒的各种条件，观察实验动物的毒性反应，再外推到人
  • 体外试验(in vitro test)：利用离体器官、培养的细胞或细胞器进行毒理学研究
  • 体内试验(in vivo test)：整体动物试验，多采用哺乳动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、仓鼠、狗和猴等
• 基本概念：
  • 毒理学（toxicology ）是一门研究在特定条件下，外源物（化学、生物、物理）对生物体有害作用的综合性学科。
  • GXP
    • GAP: Good Agriculture Practices
    • GLP: Good Laboratory Practices
    • GCP: Good Clinical Practices
    • GMP: Good Manufacture Practices
    • GSP: Good Supply Practices
    • GUP : Good Using Practices

毒代动力学

• 药物毒代动力学：在毒性试验条件下，研究大于治疗剂量的药物在毒理实验动物体内的吸收、分布、代谢和排泄的过程及其随时间的动态变化规律，阐明药物或其代谢产物在体内的部位、数量与毒性作用间的关系
• 吸收
• 分布
• 代谢
• 排泄
  • 肾脏排泄
    • 肾排泄是肾小球滤过、肾小管分泌及肾小管重吸收的总和
    • 肾小球滤过：除了与血浆蛋白结合的药物外，游离药物及药物的代谢物均通过肾小球滤过进入肾小管
      • 受蛋白结合率影响
    • 肾小管分泌：两个主动转运系统——弱酸性分泌系统和弱碱性分泌系统。均为非特异性，可发生竞争性抑制（丙磺舒和青霉素联用）
      • 不受蛋白结合率影响
    • 肾小管的重吸收：主要以简单扩散方式。脂溶性大的药物易被再吸收，排泄缓慢——尿液pH影响药物重吸收。
  • 胆汁排泄
    • 阴离子（有机酸类）转运系统
      • 对氨基马尿酸、磺溴酞、青霉素等
    • 阳离子（有机碱类）转运系统
      • 奎宁、红霉素等
    • 中性化合物转运系统
      • 强心苷等
  • 其它途径排泄：汗液、泪液、唾液、乳汁、呼吸道、头发和皮肤
    • 如毒品的毛发检测
• 实验研究
  • 实验阶段
    • 预试验
      • 用最少量动物来估计血液/组织药物浓度范围、分析方法所需的检测限及毒代研究最优采样时间点
    • 正式试验
      • 产生一系列血液/组织药物浓度数据, 计算毒代参数
    • 与毒理实验相结合的毒代
      • 相伴毒代动力学阶段, 判断体内药量和持续暴露对动力学参数的影响
    • 注意点
      • 建立并确证特异性好、灵敏度高的血药浓度测定方法
      • 应用与临床相同给药途径和药物剂型进行毒代动力学研究，以便比较不同种属动物的药物全身暴露程度与毒性之间的关系
      • 应该有适宜的动物数量。如采样影响毒性研究时, 需增加毒性试验的动物数, 必要时应设卫星试验组
      • 测定目标物可以是原形药物也可以是活性代谢物。当一种药物代谢成数种活性代谢物时, 且明显影响组织或靶组织反应时，应主要测定代谢物的浓度
      • 适宜的采样时间点以满足药物或其代谢物血液中AUC的计算要求。通常时间要达到3个半衰期以上。但同一动物采样次数不宜太多。除血药浓度，有时还需要测量组织药物浓度
      • 正态分布的数据和参数，结果以平均值和相对标准差表示。偏态分布的数据用中位数表达
  • 在各项中的实施
    • 单次染毒毒性试验
      • 药物研发早期。毒代动力学实验结果可预测某一给药时间间隔药物全身暴露速度和持续时间，有助于后期试验剂量水平以及药物剂型的选择。
    • 重复染毒毒性试验
      • 通过实验前后Css和AUC变化的研究，可获得全身暴露情况、性别和种属差异、剂量相关性、是否有潜在的蓄积倾向和肝药酶的诱导或抑制作用等信息，并对毒性试验的结果进行解释
    • 遗传毒性研究
      • 通过测定血浆或全血药物浓度和相关物质的浓度水平来描述和评价所用动物种属的药物全身暴露水平和特定组织药物暴露情况。
    • 致癌性试验
      • 进行预试验确定染毒的剂量范围和染毒方式。以最大耐受量(MTD)或治疗剂量的100倍作为致癌试验的高剂量。在各种剂量水平和致癌试验的不同阶段对药物和/或代谢产物的暴露水平进行测量，并结合致癌试验的结果进行评价
    • 生殖毒性研究
      • 在孕期和哺乳期试验中进行的毒物动力学测定，包括在特定时期对母体、胚胎、胎仔或新生动物进行的药物暴露评价；还应该包括评价受试物从乳汁分泌对新生动物全身暴露的作用
      • 对于某些不能证实受试物具有胎盘转运的动物种属，对其生殖毒性试验结果的解释应加以注意
  • 反复给药的组织分布研究
    • 在单剂量结果出现或提示药物或代谢物在器官或组织积蓄倾向时
    • 血液中药物或代谢物的稳态水平显著高于单剂量给药研究时所预测的浓度时
    • 组织分布与组织病理变化有关时
    • 希望开发具有特异性分布的靶向释放药物时
  • 研究报告
    • 方法建立和确证资料
    • 药物样品处理程序
    • 动物选择， 给药方案、剂量和给药途径的选择及其依据
    • 毒代动力学数据和统计分析
    • 全身暴露的评价
    • 毒代结果与毒性结果的解释和评价

化学致癌

• 基本概念
  • 致癌作用： 是导致癌症的一系列内在或外部的多步骤过程，具体包括任何良性或恶性肿瘤的起源或发生
  • 致癌物： 环境中能诱发机体产生肿瘤、增加其发病率和死亡率的化学物质
  • 直接致癌物或初发致癌原：未经代谢或生物转化就足以激发致癌效应的母体化合物
    • 如各种烷化剂 （如环磷酰胺、氮芥、噻替哌、环已亚硝脲、白消安等)和某些金属致癌物（如砷、镉、镍、铬）
  • 间接致癌物：进入机体后需经代谢或生物转化成为另一种化合物，才能诱发致癌作用的化学物质
    • 如天然的黄曲霉毒素、环孢素等
  • 促癌物：本身无致癌作用，只有与致癌剂同时存在时，能增加后者致癌活性的化学物质
    • 如佛波酯、巴豆油、煤焦油中的酚类、激素
• 按作用机制分类
  • 遗传毒性致癌物
    • 与DNA共价结合，造成基因突变或染色体结构和数目的改变，最终导致癌变
  • 非遗传毒性致癌物
    • 不与DNA反应，不改变DNA初级序列（促进细胞过度分裂增殖，增加细胞对致癌物的敏感性或促进已发生基因型改变的细胞克隆扩增）——改变转录与翻译相关基因的表达而起作用。
    • 促癌剂
      • 本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给促癌剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌
      • 丁基羟甲苯、DDT、多卤联苯、氯丹、七氯和四氯二苯并对二恶英（TCDD）
    • 激素
      • 改变内分泌系统平衡及细胞正常分化
      • 己烯雌酚，雌二醇
    • 细胞毒剂
      • 引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展
        • 细胞代偿性增生
      • 次氮基三乙酸、氯仿
    • 过氧化物酶体增殖剂
      • 导致细胞内氧自由基过量生成，诱发肝癌
      • 增塑剂邻苯二甲酸乙基己酯，降血脂药氯贝丁酯、降脂异丙酯
    • 免疫抑制剂
      • 对病毒诱导的恶性转化起增强作用
      • 硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤 (白血病或淋巴瘤)
    • 固态物质
      • 塑料，石棉
  • 临床常见致癌药物
• 观察化学致癌作用的方法
  • 1||| 短期致突变性和致癌性筛选实验
    • 实验系统：微生物、昆虫、哺乳动物细胞
    • 检测参数：基因突变、染色体效应、DNA修复
  • 2||| 体外转化实验
    • 以体外诱发细胞恶性转化（细胞形态、细胞生长能力、生化表型及动物体内成瘤）能力为终点，评价化合物致癌活性。
  • 3||| 动物致癌实验
    • 采用啮齿动物的皮肤、结肠、乳腺、肝脏、胰腺和膀胱等为模型，通过在遗传毒性致癌剂处理动物之前、同期或之后用促癌剂或共致癌剂处理动物，确定是否增加肿瘤的发生率，并以此评价化合物的促癌或协同致癌能力。
  • 4||| 有限致癌实验
    • 即哺乳动物短期致癌实验
    • 实验终点为肿瘤形成或癌前病变，实验时间比长期致癌实验短很多。常见有小鼠皮肤瘤、小鼠肺肿瘤、雌性大鼠乳腺癌和大鼠肝转变灶诱发实验
  • 5||| 转基因动物模型
    • 转癌基因小鼠
      • 可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右
    • 抑癌基因敲除小鼠
      • p53+/-或p53-/-小鼠
    • 转穿梭质粒的转基因动物小鼠
      • 转入带有报告基因的穿梭载体如lacI、lacZ，是研究体内基因突变的转基因动物模型
  • 6||| 哺乳动物长期致癌实验
• 多阶段过程
  • 启动阶段/引发阶段
    • 致癌物直接作用于DNA的初级序列，引起基因突变，使单个细胞或少量细胞发生永久性的、不可逆的遗传性改变（此种细胞称为启动细胞 ）
  • 促进阶段/促长阶段→演变/进展阶段
    • 细胞在致癌作用第一阶段变成启动细胞后，在促癌剂作用下克隆扩增→增殖演变为具有外源基因的肿瘤细胞群。
• 作用机制
  • DNA加合物形成
    • DNA加合物形成的严重性取决于加合物在DNA链上的位置和加合物的性质
  • 蛋白质加合物形成
    • 化学致癌物以原形或代谢产物的形式与蛋白质共价结合形成化学致癌物-蛋白质加合物。蛋白质加合物增多与肿瘤发生危险性增加呈正相关
  • 诱发超额DPC
    • DNA-Protein crosslinks，DPC
    • DPC对DNA的构象与功能产生严重影响
    • 与其他类型DNA损伤相比，DPC较难修复，在DNA复制过程中，易造成一些重要基因如抑癌基因等丢失
  • DNA损伤修复能力
  • 癌基因、原癌基因与抑癌基因
    • 化学致癌物可激活癌基因和/或原癌基因，抑制抑癌基因
    • 抑癌基因如P53纯合缺失或失活，细胞恶性转化
  • 表观遗传
    • 通过影响翻译改变基因表达，进而促进细胞分裂增殖，诱发肿瘤
    • 直接作用是指直接刺激细胞分裂增殖
    • 间接作用是指没有直接刺激细胞分裂增殖，但有明显细胞毒性，引起细胞变性坏死，机体细胞再生，从而间接刺激细胞增殖，导致细胞恶变及癌变

新药临床前安全性评价

• 临床前安全性评价又称药物非临床安全性研究，用实验毒理模型（包括整体动物、离体器官或组织、细胞或受体等）研究药物毒性的性质、强度以及其可逆性程度，并结合药效学等资料，预测新药临床试验的安全性。
• GLP
  • Good Laboratory Practice for Nonclinical Study药物非临床研究质量管理规范
  • 理念（事前布控，事后可塑）
    • 写所要做的
    • 做所已写的
    • 记录所做的
    • 报告记录的
  • 具体要求
    • 记录化
    • 文书化
    • 证据化
  • 质量保证体系
    • 
    • 建立机构、规定各类人员的资格和职责
      • 建立机构、聘任人员人员应具备相应的专业背景和经验，经过GLP及有关SOP的培训，明确自己在实验室工作的职责
    • 保证够用和稳定的实验设施和设备
      • 实验环境不影响实验的结果
      • 仪器设备能够满足所从事的实验
      • 定期维护和校准仪器设备
      • 存有仪器设备的使用和维护的记录
    • 保证可靠的实验系统和材料
      • 实验动物来源可靠，品系和级别符合试验要求
      • 所采用的测定或检验方法经过验证
      • 样品的处理和测定及时
      • 样品的接受、保存条件、处理过程、测定条件均有记录
      • 实验用试剂和药品均有完整的标签（品名、来源、度、配制时间、有效期）
    • 制订并执行SOP
      • 供试品和对照品的接收、标识、保存、处理、配制、领用及取样分析
      • 动物房和实验室的准备及环境因素的调控
      • 实验设施和仪器设备的维护、保养、校正、使用和管理
      • 计算机系统的操作和管理
      • 实验动物的运输、检疫、编号及饲养管理
      • 实验动物的观察记录及实验操作
      • 各种实验样品的采集、各种指标的检查和测定等操作技术
      • 濒死或已死亡动物的检查处理
      • 动物的尸检以及组织病理学检查
      • 实验标本的采集、编号和检验
      • 各种实验数据的处理
      • 工作人员的健康检查制度
      • 工作人员的培训制度
      • 质量保证部门的工作规程
      • SOP的制订、修订和管理
      • 非临床研究机构认为需要制定SOP的其它工作
    • 保证实验记录和报告的真实可靠
      • 实验记录的内容
        • 实验名称
          • 首次实验记录必须注明课题名称和实验名称
        • 实验人员
          • 应记录所有参加实验的人员及相应的职责
        • 实验时间
          • 每次实验必须在记录纸的适当位置按年—月—日顺序记录实验日期和时间，例如：2006—12—25 14﹕00—17﹕00
        • 实验方法
          • 常规实验方法应在首次实验记录时注明方法来源
          • 创新的实验方法应详细记录实验步骤和细节。
        • 实验材料
          • 详细记录所采用的仪器设备名称、型号及其度量精度
          • 实验动物种属、来源及合格证编号
          • 体外试验实验系统，细胞、微生物、组织、器官等）的来源、鉴定情况等
          • 主要试剂的生产厂家、规格和生产批号
          • 自制试剂应在首次记录中详细说明配制方法、时间及保存条件
          • 实验材料如有变化，应在相应的实验记录中加以说明
        • 实验环境
          • 详细记录实验当天的天气情况和实验微小气候（如光照、通风、温度及湿度等）
        • 实验结果
          • 应准确记录定量观察指标的实验数据和定性观察指标的实验变化
          • 在不同的时间点上，从同一个受试对象上观测来的数据必须写在与时间点对应的位置上，不得错位
        • 结果分析
          • 每次实验结果应做明确的文字小结，如有图片（如序列图、电泳图、照片等）则附必要的图片说明。对与预期结果不符的结果，要详细分析其原因
        • 实验记录的用纸
          • 所有实验记录必须使用统一印制的实验记录本或科技档案专用纸，档案专用纸和实验记录本的用纸幅面，按本单位归档要求设定
        • 实验记录本
          • 药物研究的实验记录应根据实验性质记录在固定的一个或多个记录本上，一个性质相同实验的多本记录，应按时间顺序编号。不得在同一记录本上记录其它课题的实验记录，不得将实验记录写在记录纸背面或装订线以外。实验记录本的页数不得擅自撕下，不得任意涂改或挖补，应保证完整无缺。
        • 电子记录
          • 电子记录应具有原始、实时、准确、完整、可靠和可溯源性。
          • 所有电子记录的修改必须留有痕迹，确保起始记录和试验进程中的记录都是可以复原的。
        • 实验记录的书写
          • 实验记录本（纸）竖用横写，书写必须使用蓝黑墨水或碳素墨水。不得使用铅笔、圆珠笔、红蓝铅笔、纯蓝墨水及红墨水笔记录。
          • 实验记录必须使用中文录，使用规范汉字，不得用外文或中文混记，不得使用自造字和非规范简化字
        • 实验记录的书写
          • 常用的英文缩写（包括实验试剂的外文缩写）必须符合规范并已在出版界得到认可，首次出现时必须用中文加以注释，实验记录中属译文的必须用括号注明其外文名称。
          • 实验记录使用专业术语必须规范，计量单位应采用国际标准计量单位，有效数字的取舍应满足实验要求。
        • 实验记录的更正
          • 实验记录不得随意删除、修改或增加数据。如系写错确须更正，在需更正处画一横线，不可完全涂黑，保证更正前记录能够辨认，并由更正人签字，注明时间及原因或依据。
        • 图片，照片
          • 实验图片、照片应用胶水贴在记录的相应位置上，底片装在统一制作的底片袋内，相互对应编号后，用胶水贴在照片旁。除一次成相和仪器自动打印的图片外，不得有图片无底片，底片不得用其它材料粘贴，也不得粘贴在其它位置。不得用金属钉、胶带纸固定照片（底片），不得将照（底）片贴在记录纸背面。
        • 图表记录
          • 示意图、 草图、表格应使用必要的工具绘制
          • 用热敏纸打印的，须保留其复印件
          • 连续打印生成的图谱、结果原件不能剪断，应保留其连续性
        • 实验记录的签署和检查
          • 每次实验后，应由实验负责人和记录人在记录后签名，以示负责
        • 实验记录要求
          • 及时准确
            • 实时、实地记录，不得补记或随意增减数据，采用和仪器精确度相适应的有效数字
          • 真实完整
            • 必须和实际测定值保持一致，应包括样品名称/编号、所属实验项目、送样时间、样品处理和保存方法、测定时间、实验条件、测定方法、测定结果等，每项实验的操作者、记录者、复核者应签字
          • 可溯源
            • 实验报告中的内容可溯源至原始记录
    • 质量保证部门（QAU）
      • 非临床研究机构应设立独立的质量保证部门，其人员的数量根据非临床研究机构的规模而定（5%）
      • 目的：确保非临床研究机构的设施、设备及实验的运行管理符合GLP的要求
      • 职责：文件审查、内部或外部审核、向管理层报告审查或审核结果、保存文件、接待药品监督部门的检查、提供建议和培训。
• 申请Ⅱ期临床的临床前
  • 重复给药毒性试验：两种动物，临床拟用周期的3-4倍
  • 安全性药理试验：扩展试验
  • 生殖毒性试验：三段试验（一般生殖、致畸敏感期、围生期毒性试验）
  • 致癌试验：动物终生试验
  • 其他安全性评价
• 申请Ⅰ期临床的临床前
  • 注意不是Ⅰ期临床（人体实验）的内容，而是申请Ⅰ期临床之前的非临床实验要求内容
  • 单次给药毒性试验 ：一般用两种动物、两种给药途径。不强求精确的LD50，重视毒性反应。
  • 重复给药毒性试验：两种动物，不短于临床拟用周期
  • 安全性药理试验：核心组合
  • 致突变试验：基因突变、染色体畸变、 DNA损伤与修复
  • 生殖毒性试验：致畸敏感期试验需用两种动物
  • 致癌试验：短期试验
• 局限性
  • 实验动物和人对药物反应存在着种属差异
  • 实验动物的数量有限，发生率低的毒性反应难以发现
  • 临床患者可能对某种药物非常敏感而出现特异性反应
  • 实验所用的动物多是健康的，而临床患者则可能患有多种疾病
  • 动物毒性试验中采用大剂量的做法也与临床相差甚远，特别是那些毒性低、给药量很大的药物，有时会给实验结果造成假象
• 内容
  • 临床前也叫非临床
  • 一般药理试验（安全性药理试验）
  • 急性毒性试验（单次给药毒性试验）
  • 长期毒性试验（重复给药毒性试验）
  • 一般毒性研究
  • 致突变试验
  • 生殖毒性试验
  • 致癌试验
  • 特殊毒性研究
  • 免疫毒性和/或免疫原性试验
  • 其他毒性试验 ：
    • 药物依赖性试验
    • 刺激性试验（皮肤刺激、肌肉刺激、血管刺激、眼刺激、直肠刺激、阴道刺激等 ）
    • 过敏性试验（ASA、PCA）
    • 溶血试验（体内和体外）
    • 制剂常规安全试验
• 目的/要求
  • 发现毒性反应
  • 找出中毒剂量或无观察到不良反应的剂量水平（NOAEL）
  • 
    确定毒性靶器官
  • 搞清毒性是否可逆
  • 确定安全范围

一般毒性研究

• 急性毒性试验
  • 也叫单次给药毒性试验，研究实验动物一次或24小时内多次给予受试物后一定时间内所产生的毒性反应
  • 给药剂量
    • 对于非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，给药剂量没有必要达到致死水平
    • 给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性(危及生命的) 剂量，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组
  • 观察时间
    • 一般连续观察至少14 天，观察的间隔和频率应适当
  • 观察指标
    • 一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）
    • 死亡情况（时间、濒死前反应等）
    • 体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。
  • 病理性检查
    • 所有的试验动物均应进行大体解剖，任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查
  • 综合评价
    • 安全范围、毒性严重程度及可恢复性；靶器官情况，初步判断受试物的生物利用度
  • 试验方法
    • 半数致死量法
      • 经典方法
      • 预试验得出0%-100%的死亡剂量范围内，设计5-6个剂量组。各剂量组间距为1:0.65-0.85,高剂量70%死亡率以上，低剂量死亡率30%以下。
      • 多用啮齿动物
      • LD50计算方法
        • Bliss法（改良Bliss法）
        • 寇氏法
        • 改良寇氏法
        • 何尔恩法（简化概率法）
    • 最大给药量法
      • 对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24 小时内多次给药(剂量一般不超过5g/kg 体重)，观察动物出现的反应。一般使用10-20 只动物（多用啮齿动物），连续观察14 天
    • 近似致死剂量法
      • 主要用于非啮齿类动物，6只健康的Beagle 犬（6-12月龄）或猴（3-5岁）
      • 步骤
        • 1||| 根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。
        • 2||| 按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表
        • 3||| 在剂量序列表范围内，每间隔一个剂量给1只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量
        • 4||| 用二者之间的剂量给一只动物
        • 5||| 如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。
    • 固定剂量法
      • 观察终点：不是死亡，而是明显的毒性体征
      • 剂量设置：选择5、50、500 和2000 mg/kg 四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg 剂量。单次给药。
      • 动物：首选大鼠，给药前禁食6-12 小时，给受试物后再禁食3-4 小时
      • 预试验
        • 1||| 根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量
        • 2||| 若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg 作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试
          • 2000㎎/㎏无死亡，难道不试一试5000㎎/㎏吗？
        • 3||| 每个剂量给一只动物，预试一般不超过5 只动物
        • 4||| 每个剂量试验之间至少应间隔24 小时。给受试物后的观察期至少7 天，如动物的毒性反应到第7 天仍然存在，尚应继续观察7 天
      • 正式试验
        • 每个剂量至少用10 只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg 引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。
    • 上下法（阶梯法，序贯法）
      • 特点
        • 节省动物。观察毒性表现，估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。
      • 限度试验
        • 最多用5 只动物进行验。试验剂量为2000 mg/kg，特殊情况下也可使用5000 mg/kg。
      • 主试验:
        • 由一个设定的给药程序组成，在此程序中，每次给药1 只动物，间隔至少48 小时。给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程度
        • 在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。一般采用剂量级数因子为3.2的剂量序列为1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000 mg·kg-1进行试验，第1只动物给予低于LD50的最接近的估计值，无估计值时可从175 mg·kg-1开始
    • 累积剂量设计法（金字塔法）
      • 动物
        • 在非啮齿类动物进行
      • 分组
        • 8 只动物，分对照组和给药组，每组4 只动物，雌雄各2 只
      • 剂量
        • 可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000 mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg
      • 给药
        • 通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。
• 长期毒性试验
  • 也叫反复给药毒性试验
  • 目的和意义
  • 动物：大鼠、Beagle犬/猴。
    • 年龄
      • 应依试验周期的长短而定，通常大鼠为6-9周龄，Beagle犬为6-12月龄或猴3-5岁
    • 分组
      • 大鼠每组雌雄各10~30只，犬或猴每组雌雄各3~6只
      • 如大鼠长期毒性试验无明显毒性，则可免做犬等长期毒性试验。
  • 方法
    • 一般设三个剂量组和一个正常对照组或溶媒、赋形剂组
    • 低剂量组原则上应高于同种动物药效的有效剂量，而动物不出现毒性反应
    • 高剂量组原则上能使动物产生明显或严重的毒性反应，甚至有20%的动物死亡
    • 则在高、低剂量间再设一个中剂量组（应相当于药效学试验的高剂量）
  • 给药途径
    • 原则上应与临床拟用给药途径相同，若试验周期长，大鼠静注有困难时，可用其他适宜途径代替
    • 3个月以上试验期时，每周可6天给药
      • 就是说可以不用每天给药
  • 给药周期
  • 给药期间的检查时间间隔
  • 观察指标
    • 和急性毒性试验类似
  • 检测指标
    • 血液学指标
    • 血液生化学指标
    • 尿液分析指标
    • 组织病理学检查
    • 特殊检查
      • 可能引起眼、耳毒性的药物，应增加眼、耳毒性的检查。
      • 有些药物尚需研究对酸碱平衡、水盐代谢的影响。
      • 非啮齿动物还应进行体温和心电图的检查。
  • 恢复期观察
    • 长期毒性试验应在给药结束后对部分动物进行恢复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。应根据受试物的代谢动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和恢复情况确定恢复期的长短（一般观察2-4周）
  • 毒物代谢动力学
    • 指结合长期毒性试验进行的考察药物系统暴露的代谢动力学研究，描述实验动物的系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间的关系。
  • 结果分析与评价
    • 正确理解均值数据与单个数据的意义
      • 啮齿类动物
        • 均值的意义通常大于单个动物数据的意义；历史和文献数据可作为分析参考
      • 非啮齿类动物
        • 动物数量少、个体差异大，单个数据往往具有重要毒理意义；结果须与给药前数据、对照组数据以及历史数据进行多重比较分析；文献数据参考价值有限
    • 综合考虑数据的统计学与生物学意义
      • 如RBC、WBC、血小板计数，由于系统误差，可能P<0.05，但如果均在正常范围内，则无生物学实际意义
    • 判断毒性反应对于临床试验的意义
      • 应对异常数据进行合理解释
      • 综合考虑参数变化，正确判断毒性反应
      • 避免简单地将动物结果外推至人，也不能忽略动物毒性反应

特殊毒性研究

• 遗传毒性（致突变作用）
  • 试验方法
    • 细菌回复突变实验（Ames试验）
      • 子主题
      • 菌株
        • 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌
        • 色氨酸营养缺陷型埃希大肠杆菌
      • 方法
        • S9指经肝微体酶诱导剂（多氯联苯）处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。主要含有混合功能氧化酶(MFO)
        • S9可代谢活性受试物，缺点：随动物种属或器官不同而有差异；含 有大量亲核物质而可能影响试验的敏感性。
        • 掺入法
        • 点式法
      • 结果判断
        • 只要在一种受试菌株中得到阳性结果，即可判断受试物是致突变物
        • 仅当五种菌株都得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物
        • 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物
        • 加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物
      • 优缺点
        • 优点
          • 检出率高
          • 灵敏度较高
          • 经济适用
          • 由于在测试系统中加入了S9，弥补了一般试管内试验的缺点
        • 缺点
          • 微生物的遗传信息仅相当于哺乳动物的1/6，结构也较简单
          • 哺乳动物有较微生物完善复杂的DNA修复系统，遗传物质突变后较易修复。微生物缺乏免疫功能
          • 对水溶性低物质可出现假阴性
          • 抑菌剂可抑制
    • 微核试验（micronucleus test，MNT）
      • 微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 细胞质中微核来源： 断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞
      • 微核试验是观察受试物能否产生微核的试验
      • 主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂
      • 材料
        • 啮齿类动物试验（在体给药，骨髓涂片、Giemsa染色）
        • 体外试验
          • 中国仓鼠成纤维细胞 （CHL）
          • 中国仓鼠卵巢细胞 （CHO）
          • 中国仓鼠肺细胞（V79）
        • 蚕豆根尖试验
        • 毛囊微核试验
        • 鱼微核试验
      • 染色显微观察微核
        • 为嗜染性与细胞核相似的圆形或椭圆形小体，一般小于间期核的1/3～1/5
    • 染色体畸变分析
      • 观察染色体形态、结构和数目改变称为染色体畸变分析，又称细胞遗传学试验
      • 将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜检查染色体是否畸变和分离异常
      • 材料
        • 哺乳动物试验
          • 小鼠骨髓细胞染色体畸变试验
          • 小鼠睾丸细胞染色体畸变试验
        • 体外实验
          • 人外周血淋巴细胞
          • 中国仓鼠成纤维细胞 （CHL）
          • 中国仓鼠卵巢细胞 （CHO）
          • 中国仓鼠肺细胞 （V79）
    • 姐妹染色体交换试验
    • 果蝇伴性隐性致死试验
      • 果蝇眼睛颜色性状由X染色体上的基因决定，并与X染色体的遗传相关联的特征来作为观察在X染色体上基因突变的标记。以染毒的野生型雄蝇（红色圆眼，正常蝇），与Basc（Muller-5）雌蝇（淡杏色棒眼，在两个X染色体上各带一个倒位以防止F1代把处理过的父系X染色体和母系X染色体互换）交配，如雄蝇经受试样品处理后，在X染色体上的基因发生隐性致死，则可通过上述两点遗传规则于F2代的雄蝇中表现出来，并籍眼睛颜色为标记来判断试验的结果。即根据孟德尔分类可产生四种不同表型的F2代，有隐性致死时在F2代中没有红色圆眼的雄蝇
    • 彗星试验
      • 原理：真核细胞DNA分子量大，以超螺旋结构存在于细胞核中。用琼脂糖凝胶将细胞包埋后，在细胞裂解液中，细胞膜、核膜等生物膜结构被破坏，细胞内的蛋白质、RNA及其他成分进入凝胶中，然后扩散到裂解液中。但核内的DNA仍然缠绕在核骨架上并留在原来的位置。在碱性电泳液中（PH>13）,DNA双链解螺旋，且变性为单链
      • 电泳中，如果DNA没有损伤，则将停留在原位，染色后呈圆形的荧光团，无拖尾出现。如果DNA受损，断裂的碎片进入到凝胶中，在电场的作用下，DNA碎片离开原位向阳极迁移，形成拖尾。
      • DNA受损越严重，断裂越多，产生的碎片就越多、越小，则向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离也越长，荧光染色后就能看见彗星样尾长并且荧光强度增强
  • 观察方法新进展
    • 转基因小鼠致突变检测系统
    • 微核自动化检测技术
    • 荧光原位杂交技术（FISH）
  • 致突变试验中some problems
    • 阴性和阳性对照的设立
    • 体外试验的活化系统
    • 致突变试验与致癌试验的关系
      • 致突变试验仅可检测出遗传毒性致癌物与非遗传毒性非致癌物；
        • 假阳性：遗传毒性非致癌物
        • 假阴性：非遗传毒性致癌物；
      • 致突变试验是短期致癌物检测试验中的一大类，需与其他试验结合
    • 试验结果在毒理学安全性评价中的作用
• 致癌毒性
  • 适用范围
    • 临床疗程在6个月以上的药物或需间断性长期反复治疗慢性复发性疾病（如过敏性鼻炎、忧郁症、焦虑病等）的药物及长期接触的缓慢释放的药物
    • 已知与人类相关的具有潜在致癌性的同类化合物或构效关系显示潜在致癌危险性的物质
    • 经长期毒性试验已显示有癌前期病变的证据或长期滞留在体内的母体化合物、代谢产物能产生局部组织反应或其它病理生理反应
    • 已明确有遗传毒性的物质，如果临床需长期使用，则有必要进行致癌试验，但属肿瘤治疗药或用于预期生存期短暂的人群，则无必要进行致癌试验。
  • 试验方法
    • 培养细胞恶性转化试验
    • 单细胞凝胶电泳（彗星试验）
    • 短期致癌试验
      • 如诱发小鼠肺肿瘤试验：选用6~8周龄、15~20g体重的近交系小鼠；每周给受试物（一般是腹腔注射）3次，连续8周，遂后继续观察30~35周；肺肿瘤发生率
    • 长期致癌试验
      • 幼年大、小鼠；大鼠连续给受试物2年，小鼠1.5年
• 生殖发育毒性
  • 分类没有整理好
  • 三段分类
    • I段：妊娠前及妊娠初期的给药试验，生育力与早期胚胎发育毒性试验，也叫一般生殖毒性试验
    • II段：胚胎器官形成期的给药试验，胚胎-胎仔发育毒性试验，也叫致畸敏感期毒性试验
    • III段：围生期及授乳期的给药试验，也叫围生期试验
  • 设计方案
    • Ⅰ段
      • 在交配前给药
      • 目的
        • 评价生殖细胞接触药物后对受孕能力、生殖功能及子代有无不良影响
      • 给药
        • 雌性
          • 交配前到妊娠中期或胚胎着床
        • 雄性
          • 交配前
      • 评价内容
        • 配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等
        • 对于雌性动物，还应对动情周期、受精卵输卵管转运(tubal transport)、着床及胚胎着床前发育的影响进行检查
        • 对于雄性动物，则应观察生殖器官的病理组织学检查方法可能无法检测出的功能性影响。
      • 动物
        • 大鼠和家兔
    • Ⅱ段
      • 给药
        • 从着床到硬腭闭合期间给药
      • 评价内容
        • 评价的内容包括为妊娠雌性动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎胎仔的死亡、生长的改变和结构的变化等
      • 动物
        • 大鼠和家兔
    • Ⅲ段
      • 给药
        • 胚胎着床期到幼仔离乳期
        • 孕期15天开始给药至生产后28天止
      • 动物
        • 一般选择大鼠
      • 评价内容
        • 妊娠期雌性动物较非妊娠期雌性动物增强的毒性、出生前和出生后子代的死亡情况、生长和发育的改变以及子代的功能缺陷等，同时也包括F1代的行为、性成熟和生殖功能
      • 具体指标
        • 出生存活率、4天存活率、21天存活率、出牙、开眼、睾丸下降、阴道开口；行为反射指标
    • • 交配期可忽略吧？？
      • 感觉图有一点错误呢
• 药物依赖性
  • 适用范围
    • 记忆方法：结构，受体，作用，成分，代谢物，用途，临床
    • 1||| 与已知具有潜在依赖性化合物结构相似的新化合物
    • 2||| 作用于中枢神经系统，产生明显的镇痛、镇静、催眠及兴奋作用的药物；
    • 3||| 复方中含有已知较强依赖性成分的药物
    • 4||| 直接或间接作用于中枢阿片受体、大麻受体、多巴胺受体、去甲肾上腺素受体、5-羟色胺受体、N-胆碱受体、γ-氨基丁酸受体、苯二氮卓受体等受体的药物；
    • 5||| 已知代谢物中有依赖性成份
    • 6||| 拟用于戒毒的药物
    • 7||| 原认为不具依赖性，而在临床研究或临床应用中发现有依赖性倾向的药物。
  • 研究内容
    • 神经药理学试验
      • 利用神经药理学方法，对行为学效应和神经递质进行测定，初步判断受试物有无依赖性倾向，可通过药效学试验、一般药理学试验或毒理学试验进行观察。
    • 躯体依赖性试验
      • 小鼠、大鼠、猴
      • 自然戒断试验
        • 连续给予动物一段时间的受试物后，突然停止，观察动物出现的戒断症状，与同类代表药物作对比，按戒断症状的严重程度判断受试物身体依赖性的潜力
      • 催促戒断试验
        • 指在短期内给予动物大剂量受试物，然后注射给予受体阻断药纳洛（naloxone）后1~2小时内，动物出现的戒断症状与其程度，但此法仅适用于对阿片受体激动药的竞争性阻断
      • 替代试验
        • 阿片类、巴比妥药物等各自具有基本相同的药理作用，给动物阿片/巴比妥类药物并使之产生身体依赖性后停药，代之以受试药，观察动物是否发生戒断症状
    • 精神依赖性试验
      • 自身给药试验
      • 药物辨别试验
      • 条件性位置偏爱试验

局部用药的全身毒性试验

• 刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。刺激性试验是观察动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应
• 皮肤用药制剂的毒性研究
  • 皮肤用药急性毒性试验
    • 目的
      • 观察动物完整或破损皮肤接受单剂量（中药制剂视情况亦可一日内多剂）受试物后，短期内（一般为7-14天）出现的毒性反应及死亡情况
    • 动物
      • 大鼠(200 g)、白毛豚鼠(300 g)和兔(2 kg)或小型猪
    • 脱毛面积
      • 约为动物体表面积的10%，破损皮肤以渗血为度
    • 剂量
      • 通常需3个剂量组，每组至少5只同性别动物，若已超过2.0g·kg-1或达有效浓度20倍以上，仍未出现异常反应或死亡，则可仅设置一个高剂量组，对死亡或濒死动物需尸解，可疑病理改变器官则需进行病理组织学检查
        • 所谓高中低剂量，不是增减厚度，因为太厚无法吸收，而是增减涂抹范围
  • 皮肤用药长期毒性试验
    • 目的
      • 观察动物皮肤长期接触受试物，经皮肤渗透吸收对局部和全身产生毒性反应的可能性及其严重程度，靶器官及其损害的可逆性，确定毒性反应剂量等
    • 动物
      • 成年健康兔（2.0-3.0kg）、豚鼠（300-450g）和大鼠（200-300g），给受试物背部需每周脱毛一次，面积约占体表面积的10%（兔150cm2、豚鼠和大鼠40cm2）。若需观察破损皮肤的长毒试验，则将脱毛消毒皮肤划破，以渗血为度
    • 剂量设置
      • 同普通长毒。若受试物剂量已超过1.0g·kg-1或达有效浓度20倍以上，仍未见毒性反应和死亡时，则仅设一个高剂量组。
    • 给药及观察
      • 每天一次，每次接触受试物至少6小时。按临床拟用疗程的2-3倍以上时间连续给药，部分动物1个月的延迟性毒性和恢复性观察，给药期和停药期应每天观察一次，其指标与经胃肠或注射给药的长期毒性试验相同。
  • 皮肤刺激性实验
    • 在急毒、长毒试验或皮肤过敏性试验中已经评价过皮肤刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的皮肤刺激性试验
  • 皮肤过敏试验
    • bueher试验
      • 1||| 动物
        • 成年豚鼠（n=20）
      • 2||| 去毛
        • 试验前24h背部两侧去毛(每侧约3×3 cm)
      • 3||| 分组
        • 阴性对照（maybe用赋形剂吧？）
        • 阳性对照：2，4-二硝基氯代苯
        • 实验组
      • 4||| 致敏接触
        • 取受试物0.2 g /ml涂在背部左侧脱毛区，并用杀菌薄膜纸固定，持续6h，用温水去除残留膏剂。d7和d14，以同样方法重复一次
      • 5||| 激发接触
        • 于末次致敏后14d，将受试物0.2 g/ml涂于背部右侧脱毛区，6h后用用温水去除残留物，即刻，24、48、72h观察皮肤过敏反应情况
      • 6||| 结果观察
      • 7||| 结论
    • 其他方法，如GPMT，LLNA等，不需要了解
  • 皮肤吸收试验
    • 整体皮肤吸收试验
      • LDV法
      • PPG法
    • 离体皮肤吸收试验
      • 静态渗透装置
      • 流动渗透装置
        • 接受液为血浆或白蛋白水溶液，以5ml/h的速度灌流， 测定不同时间灌流液的药量。依次测定皮肤的透过率
  • 皮肤光过敏性试验
    • 目的
      • 观察受试物接触皮肤后遇光照是否有光敏反应 (红斑和水肿）
    • 动物：健康白色豚鼠（n>5)
    • 分组
      • 阳性对照药组、阴性对照组和受试物组
  • 皮肤光毒性试验
    • 光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损伤的作用
    • 动物
      • 白毛成年豚鼠（n>6)
    • 波长为320-400nm的UVA
    • 分组
      • 阴性对照
        • 给予赋形剂或溶媒
      • 阳性对照组
        • 给予8-甲氧基补骨脂素
      • 受试物不同剂量组
        • 受试物低剂量组给予临床用药浓度，高剂量组给予不引起皮肤刺激反应的浓度。
  • 很难区分诶
  • 皮肤用药毒性试验的注意事项
    • 设计赋形剂对照组
    • 若受试药拟用于受损皮肤时，宜进行破损皮肤的急毒、长毒试验
    • 高剂量的设计宜符合制剂工艺要求，以剂型允许配制浓度和给药量为宜
    • 科学的脱毛方法
    • 与已知光敏剂结构相似者，要进行光敏试验
    • 创制新药要做皮肤吸收试验，口服→皮肤制剂
• 眼睛用药刺激性试验
  • 动物
    • 首选健康家兔（n＞3）
  • 分组
    • 对照组：生理盐水
    • 同体左右侧自身对照
  • 方法
    • 每睛滴入0.05-0.1ml 或涂敷0.1g 受试物，然后轻合眼睑约10 秒。给药期限应根据受试物拟用于临床的情况来决定，多次给药时每天给受试物的次数应与临床用药频率相同，连续给受试物2-4周，一般不超过4 周
  • 观察
    • 单次给药时，在给药后1、2、4、24、48 和72 h眼检
    • 多次给药时，每天给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48 和72 h眼检
    • 如果在72 h未见任何刺激症状，试验则可结束
    • 如存在持久性损伤，有必要延长观察期限，但一般不超过21 天
  • 评价指标
    • 刺激反应分值各项相加÷动物数=积分
• 肌内注射用药的局部刺激性试验
  • 动物
    • 首选健康家兔（n＞3）
  • 分组
    • 对照组：生理盐水
    • 同体左右侧自身对照
  • 用药部位
    • 股四头肌
  • 给药方法
    • 按临床给药方案给予受试物，给药容积一般1-2ml/只。给药期限应根据受试物拟用于临床应用的情况来决定，多次给药一般不超过7 d。
      • 给药体积过大会造成肌肉压迫性坏死
  • 观察方法
    • 通常单次给药时，在给药后48-96 h 对动物和注射部位进行肉眼观察
    • 多次给药时，每天给药前以及最后一次给药后48-96 h对动物和注射部位进行肉眼观察
    • 观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查
    • 留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14-21 d再进行组织病理学检查，以了解刺激性反应的可逆程度
  • 评价指标
    • 超过2认为不符合规定，不宜进行肌内注射
• 粘膜毒性试验
  • 滴鼻剂、吸入剂的毒性试验，应用于直肠、阴道制剂的毒性试验的统称
  • 急性毒性试验
    • 动物
      • 大鼠、豚鼠、兔
    • 三个剂量组，每剂量组雌雄各5只
    • 动物全身暴露于不超过20L具有不间断空气流速的特制容器内，置于容器时间至少是受试物在容器中达平衡后4h（或与黏膜接触至少4 h)，
    • 观察期至少14d，逐日观察动物的全身反应，死亡或濒死动物应进行尸解，到期处死动物，对鼻/呼吸道/直肠/阴道进行大体解剖观察，有迹象表明毒性涉及到其他器官，应进行病理组织学检查。若受试物浓度已达5mg·L-1或最大浓度（或已在临床用量的50倍以上），接触4 h仍未发生毒性反应或死亡，则不需设三个剂量组。
  • 刺激性试验
  • 角膜和黏膜及吸入性长期毒性试验
    • 其要求基本上与皮肤给药长期毒性试验相仿
    • 除观察全身反应的相关指标外，尚应重点观察给药局部和可能累及的周围组织的反应和病理损害程度。

静脉注射制剂的全身毒性试验

• 三兔一豚鼠
• 血管刺激性试验
  • 实验动物
    • 首选家兔，每组动物数不少于3 只。应设生理盐水对照，可采用同体左右侧自身对照。
  • 用药部位
    • 耳缘静脉
  • 给药方法
    • 按临床给药方案给予受试物，给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据受试物拟用于临床应用的情况来决定，多次给药一般不超过7 天。
  • 结果观察与评价
    • 肉眼观察
      • 通常单次给药时，在给药后48-96 h 对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药时，每天给药前以及最后一次给药后48-96 h对动物和注射部位进行肉眼观察
    • 组织病理性检查
      • 观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查
      • 留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14-21 d再进行组织病理学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。
• 体外溶血试验
  • 溶血分类
    • 免疫性溶血
      • 药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应
    • 非免疫性溶血
      • 包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等
  • 常规的体外试管法
    • 此处描述肉眼观察法，其他还有比色（观察）法
    • 1||| 血细胞悬液配制：取兔血XXX
    • 2||| 受试物制备
      • 静脉注射剂以使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。
    • 3||| 分组
      • 6号为阴性对照，7号为阳性对照，红细胞因渗透吸水破裂
    • 4||| 37±0.5℃温育
    • 5||| 每隔15min观察1次，1h后，每隔1h观察1次，一般观察3h
    • 6||| 结果观察
      • 溶血
        • 溶液澄明，红色，管底无细胞残留
      • 无溶血
        • 红细胞全部下沉，上清液体无色澄明
      • 凝集
        • 溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生
      • 假凝聚
        • 若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2 滴生理盐水，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚
    • 7||| 结果判断
      • 当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3 小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3 小时内发生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用
• 过敏性试验
  • 全身主动过敏试验（ASA）
    • 原理
      • 对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与IgE 抗体结合后导致肥大细胞和嗜碱性细胞脱颗粒，释放活性介质而致的全身性过敏反应
        • PCA中注射的是致敏动物的血清（含有丰富lgE抗体），注意区分
    • 实验动物
      • 通常选用体重为300-400 克的豚鼠
      • 每组动物数至少6 只
    • 分组
      • 不知道设几个不同剂量组，有没有中剂量组呢
      • 阴性对照
        • 给予同体积的溶媒
      • 阳性对照组
        • 给予1-5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质
      • 受试物低剂量组
        • 给予临床最大剂量（/kg或m2）
      • 受试物高剂量组
        • 给予低剂量的数倍量
    • 致敏
      • 静脉注射，隔日一次，共3-5 次
    • 激发
      • 末次注射后第10-14 d一次快速静脉注射致敏剂量的2-5 倍量（给药容积1-2ml）
    • 观察指标
      • 致敏期间
        • 每日观察每只动物的症状。初次，最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重
      • 激发
        • 静脉注射后立刻至30 min，按表详细观察每只动物的反应，症状的出现及消失时间。最长观察3 h。
    • 标准
• 热原试验
  • 目的
    • 判定受试物是否有致热作用
  • 动物
    • 家兔
  • 方法
    • 取3只家兔，测正常体温，耳缘静脉注射药物，每小时测体温一次，共3次。最高一次温度减正常体温
    • 如三只家兔中有一只升温超过0.6℃或三只家兔升温总和超过1.4℃时，另取5只家兔复试，方法同上
      • 2只及以上升温≥0.6℃不需要复试，就是不合格呀
  • 判断合格
    • 初试3只家兔中，体温升高均在0. 6℃以下，并且3只家兔升温的总数在1.4℃以下可判断为符合规定。
    • 复试5只家兔中，体温升高0. 6℃或0. 6℃以上的家兔数仅有1只，并且初复试合并，8只家兔的升温总数为3.5℃或3.5℃以下，可判断为符合规定。
  • 判断不合格
    • 初试3只家兔中，体温升高0. 6℃或0. 6℃以上的家兔数有2只或3只，可判断为不符合规定。
    • 复试的5只家兔中，体温升高0. 6或0. 6℃以上的家兔有2只或2只以上，可判断为不符合规定。
    • 初复试合并8只家兔的升温总数超过3.5℃，可判断为不符合规定。
• • 关于其他方法：过敏性实验（如PCA）、体外溶血试验（比色法）等，见此书

一般药理学研究

• 概念
  • 指对主要药效学作用以外进行的广泛的药理学研究，包括安全药理学和次要药效学研究
    • 次要药效学
      • Secondary Pharmacodynamic
      • 主要研究药物非期望的、与治疗目的无关的效应和机制
    • 安全药理学
      • Safety Pharmacology
      • 主要是研究药物在治疗范围内或治疗范围以上的剂量时，潜在的不期望出现的对生理功能的不良影响，
      • 即观察药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响。根据需要可能进行追加和/或补充的安全药理学研究
        • 补充的安全药理学研究（Supplemental Safety Pharmacology Studies）：是评价受试药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统以外的器官功能的影响，包括对泌尿系统、自主神经系统、胃肠道系统和其它器官组织的研究。
• 内容
  • 核心组合实验
    • 中枢神经系统
      • 定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉/运动反射和体温等的变化
    • 心血管系统
      • 测定给药前后血压（包括收缩压、舒张压和平均压）、心电图（包括QT 间期、PR 间期、ST 段和QRS 波等）和心率等的变化
    • 呼吸系统
      • 测定给药前后动物的呼吸频率和呼吸深度等的变化
  • 追加的安全药理学实验
    • 中枢神经系统
      • 对行为、学习记忆、神经生化、视觉、听觉和/或电生理等指标的检测
    • 心血管系统
      • 对心排出量、心肌收缩作用、血管阻力等指标的检测
    • 呼吸系统
      • 对气道阻力、肺动脉压力、血气分析等指标的检测
  • 补充的安全药理学实验
    • 针对三大保命系统之外的其他系统
    • 泌尿/肾脏系统
      • 观察药物对肾功能的影响，如对尿量、比重、渗透压、pH、电解质平衡、蛋白质、细胞和血生化（如尿素氮、肌酐、蛋白质）等
    • 自主神经系统
      • 观察药物对自主神经系统的影响，如与自主神经系统有关受体的结合、体内或体外对激动剂或拮抗剂的功能反应、对自主神经的直接刺激作用和对心血管反应、压力反射和心率等
    • 胃肠系统
      • 观察药物对胃肠系统的影响，如胃液分泌量和pH、胃肠损伤、胆汁分泌、体内转运时间、体外回肠收缩等
    • 其它
      • 如潜在的依赖性、骨骼肌、免疫和内分泌功能等的影响
• 给药方法与剂量
  • 给药方法应采用拟推荐临床应用的给药途径
  • 所试药物应选择产生主要药效作用的2～3个剂量，其中低剂量应参照在这种动物上产生主要药效的ED50，可一次或多次给药
  • 除受试药物选择2～3个剂量组外，还应设相应的溶剂对照组
• 可免此项的药物
  • 体内血药浓度低或其它组织器官分布很少的局部用药（如皮肤、眼科用药等）
  • 只用于治疗晚期癌症病人的细胞毒类药物，在首次用于临床前可不做一般药理学研究，但不包括具有新的作用机制的此类药物
• 阶段性
  • 一般药理学研究贯穿在新药研究全过程中，可分阶段进行。在药物进入临床试验前，应完成对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统影响的核心组合（core battery）实验的研究。追加和/或补充的安全药理学研究可在申报生产前完成

生物技术药preclinical

• 生物技术药物的特殊性
  • 结构确证不完全性
  • 种属特异性
  • 多功能性（受体分布广泛）
  • 免疫原性
• preclinical内容
  • 一般药理试验（安全性药理试验）
  • 急性毒性试验（单次给药毒性试验）
  • 长期毒性试验（重复给药毒性试验）
  • 致突变试验
  • 生殖毒性试验
  • 致癌试验
  • 依赖性试验
  • 其他毒性试验 ：局部刺激性试验、过敏性试验、溶血性试验、制剂常规安全试验等。
  • 免疫毒性和/或免疫原性试验
• 特别考虑因素
  • 微生物学安全性（外来感染源、载体传播）
  • 免疫学安全性
  • 药理学安全性（作用扩大和延伸；细胞表型、功能和定位改变）
  • 生物分布
  • 致癌性（致癌性DNA、插入突变等）
  • 一般安全性问题（蛋白质、载体的物理特征等）

临床应用的毒性问题

• 名词解释
  • 药源性疾病DID
• 药物不良反应的诊断
  • 体内再次用药试验
    • 小剂量应用可疑药物
  • 体外再用药试验
    • 淋巴细胞转化实验
    • 嗜碱性粒细胞脱颗粒试验等
  • 淋巴细胞毒性分析试验
    • 用于诊断磺胺类、芳香族抗惊厥药等引起的超敏反应
  • 辅助诊断
• 药物不良反应因果关系评价
• 防治
  • 救治原则
    • 及时停药
    • 加速药物排泄
    • 使用解救药物
  • 救治方法
    • 一般对症处理
    • 对症治疗
• 毒理学特征
  • 呼吸系统
    • 鼻塞
    • 气道阻塞
    • 反射性支气管狭窄
    • 间质性肺炎和非纤维化
    • 肺水肿
    • 肺血管栓塞、呼吸抑制
  • 消化系统
    • 恶心、呕吐、食欲不振、腹泻、腹痛、消化道出血等
    • 溃疡
    • 出血
    • 肠梗阻
    • 肝功能损害
  • 神经系统
    • 头痛
    • 嗜睡
    • 睡眠障碍
    • 癫痫发作
    • 锥体外疾病
  • 循环系统
    • 心律失常
    • 心衰
    • 血压变化
  • 血液系统
    • 再生障碍性贫血
    • 溶血性贫血
    • 粒细胞减少症
    • 血小板减少症
  • 泌尿系统
    • 急性肾衰
    • 肾小管阻塞
    • 渗透性损伤
    • 慢性肾衰
    • 假性肾功能衰竭
    • 尿潴留
    • 尿失禁
    • 血尿
  • 生殖系统
    • 勃起和射精功能障碍
    • 药源性异常勃起
    • 女性性功能和性高潮障碍
    • 性欲异常
    • 药源性不孕症
  • 皮肤
  • 眼耳损害
  • 过敏