目的基因的获取
基因文库中获取
依据目的基因的有关信息获取目的基因
如:基因的核苷酸序列
基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质……
利用PCR技术(多聚酶链式反应)扩增目的基因
发明者:凯利•穆利斯
反应过程:变性→复性→延伸
注:破坏氢键不用解旋酶，只需加热
引物的设计依据:目的基因的核苷酸序列
合成的目的基因呈指数形式增长 2ⁿ
基因表达载体的构建(核心)
鉴别受体cell是否含有目的基因 标记基因
从而将含目的基因的cell筛选出来(供重组DNA的鉴定与选择)
目的 使目的基因在受体cell中稳定存在，并且可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
将目的基因导入受体cell
转化:目的基因进入受体cell内，
并且在受体cell内维持稳定和表达的过程
目的基因导入植物cell
农杆菌转化法
特点:易感染双子叶植物和裸子植物
具有趋化性
Ti质粒的T-DNA可转移到受体cell,并整合到
受体cell染色体DNA上
早期基因工程用原核生物作受体cell的原因:原核生物（比如大肠杆菌）作为受体细胞，是利用了原核生物的几个优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
转基因超级小鼠的定义:能稳定遗传且表达外源基因的小鼠
内含子外显子都是DNA短片段，外显子是编码DNA短片段，内含子非编码DNA短片段，会在转录过程中的加工去除。
原核生物简单，基因是连续编码的，是无内含子外显子，不需要这些直接编码
真核生物复杂，基因编码区不连续，有内含子外显子
目的基因的切割和连接
限制性核酸内切酶(限制酶)
作用
识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列
并且是每一条单链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
(目的基因:切割两次 运载体:切割一次)
切割一次形成两个黏性末端or平末端
结果
DNA分子经过限制酶切割产生的DNA片段末端有两种形式
黏性末端
不同DNA分子用同一限制酶切割
形成的黏性末端都相同
同一DNA分子用不同限制酶切割
产生的黏性末端一般不同
不同限制酶切割形成的黏性末端
如果互补则可相互重新配对
识别序列特点:以中心轴线中心对称
- GC｜GC- - CCAGG-（以AC为中心轴线)
- CG｜CG- - GGTCC-
例如
Ecorl限制酶
识别序列
-G↓A T T C C-
-C T T A A↑G-
DNA连接酶
作用
将切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
运载体
质粒
性质
●裸露的，结构简单的，独立于细菌染色体即核DNA之外
并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子
●它有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中
●有特殊标记基因:四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因
●有启动子和终止子
作用:携带外源DNA的运载体
进入受体cell后，停留在cell
中进行自我复制，或整合到
染色体DNA上，随染色体进
行同步复制
注:农杆菌培养基上应加入相应的抗生素，筛选出
成功导入重组质粒的农杆菌
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因
编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子
