外泌体

外泌体的思维导图，外泌体（exosome）是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。

外泌体

• 含义
  • 含义
    • 外泌体（exosome）是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。
  • 结构
    • 它是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了9，769种蛋白质，3，408种mRNA和2，838种miRNA
      • 非特异性蛋白
        • 非特异性蛋白独立于外泌体的细胞起源，存在于所有外泌体中，例如ESCRT蛋白（Alix，TSG101），热休克蛋白（HSC70，HSC90），转运和融合蛋白（Rab蛋白，膜联蛋白，Flotillin），细胞骨架蛋白（肌动蛋白，Tublin，Cofilin），可用于检测外泌体的存在。
      • 特异性蛋白
        • 特异性蛋白质与外泌体衍生细胞相关，如MHC I类和MHC II类蛋白，转铁蛋白受体，可以反映组织和细胞的特异性，并可能介导信号传导
      • 脂质
        • 外包括鞘脂、胆固醇、神经酰胺等，不仅维持化学稳定性，还参与外泌体生物发生
      • 核酸
        • 包括DNA（单链DNA、双链DNA）和RNA（miRNA、lncRNA、mRNA、rRNA等），其中miRNA含量最丰富
  • 形成
    • 细胞质膜内陷，将一些细胞外成分和细胞膜蛋白包裹在一起，形成早期内涵体（ESEs），这些ESEs可以与其他细胞器发生物质交换，或者不同ESEs之间融合形成晚期内涵体（LSEs），进一步形成细胞内多膜体（MVBs），其中会包含许多腔内囊泡（ILVs），这些ILVs将来就可能会被释放成为外泌体。细胞形成MVBs后可能会通过与自噬体或溶酶体融合而被降解，也可能通过与质膜融合，释放其中的物质，包括ILVs，这些ILVs就是最终形成的外泌体
      • ①外泌体进入受体细胞后，将“货物”释放进入胞质内，并重新形成多泡体
      • 外泌体将“货物”释放进入胞质，但自身与细胞质膜融合。
      • 外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊受体结合，既能起到信号传导作用，也能通过内吞作用，将“货物”运入胞内。
  • 部位
    • 外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用
  • 意义
    • 外泌体的组成可能在一定程度上不仅反映了亲本细胞的组成，还反映了外泌体生物发生过程中不同分选机制的存在。
• 主题
  • 功能
    • 信号转导
      • 人类的生殖，妊娠和胚胎发育需要精细/动态的细胞间通信。
        • 精液、羊水、血液和母乳都含有具有假定功能的外泌体。 精浆外泌体与精子成熟有关。 分子谱显示，microRNAs let-7a, let-7b, miR-148a, miR-375和 miR-99a富集于来自多个人类捐赠者的精浆来源外泌体中，这些miRNA与白细胞介素(IL-10和IL-13)的表达有关，提高了外泌体在生殖道常驻免疫中发挥作用的可能性。 精浆来源的外泌体也能抑制HIV-1感染，可能是通过阻断HIV早期蛋白转录激活剂(Tat)的招募和HIV-1的后续转录。
      • 外泌体可能作为细胞之间物质和信号通的途径
        • 不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。 例如，KRAS突变表达诱导的致癌信号通过大胞饮作用促进人胰腺癌细胞外泌体摄取
      • 炎症调节
        • 外泌体可以促进/抑制炎症小体的活化，如细胞在炎症环境中分泌的外泌体可以诱导M1极化并抑制巨噬细胞的M2极化，进而促进炎症反应
      • 免疫调节
        • 免疫细胞来源的外泌体可以促进/抑制免疫反应，这取决于外泌体的组成和诱导的细胞环境，使外泌体在免疫反应和免疫特权中发挥重要作用
      • 修复和再生
        • 间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体在伤口愈合和组织再生中起着保护和治疗作用
      • 自噬调节
        • 来自不同来源的外泌体可以促进/抑制自噬
      • 外泌体生物发生和神经元细胞中分泌小泡的调节之间的交集为外泌体和神经退行性疾病的发病机制之间假定的联系提供了新的见解。
      • 外泌体影响肿瘤、肿瘤生长和转移、副肿瘤综合征和治疗耐药性。
      • 外泌体可用作疾病的生物标志物和治疗载体
      • 外泌体在免疫反应中的作用已被广泛记录。
      • 外泌体可能在代谢性疾病的出现以及心血管健康中发挥作用
• 临床应用
  • 在疾病诊断中的应用潜能
    • 外泌体存在于所有的生物体液中，并由所有细胞分泌，这使得外泌体在液体活检中具有吸引力，可用于纵向取样跟踪疾病进展
    • 外泌体的生物发生可以捕获复杂的细胞外和细胞内分子，可用于全面的、多参数的诊断检测。
    • 外泌体的表面蛋白也有助于其免疫捕获和富集。
  • 在疾病治疗中的应用潜能
    • 外泌体向病变细胞运送功能物质的特性有利于它们作为治疗载体
    • 与脂质体相比，外泌体的免疫清除率低。
    • 此外外泌体已被证实且具有良好的耐受性，无明显副作用。
• 研究潜力
  • 是否外泌体的产生和内容物随年龄变化
    • 这些信息可以为组织衰老、器官退化和程序化或过早老化提供新的见解。
    • EVs和/或外泌体是否先于地球上单细胞有机体首次出现？
    • 单外泌体的鉴定和分离以及低温电子显微镜分析
• 分类
  • 外泌体(exosomes)
    • 起源于内吞途径，直径为30-150nm，其密度约为1.11-1.19g mL-1
  • 微粒/微囊泡（microparticles）
    • 直接从质膜释放，直径约100-1000nm
  • 凋亡小体（apoptoticbody/bleb）
    • 由细胞凋亡产生，直径约为50nm-2um
  • 肿瘤小泡（large oncosomes）
    • 由肿瘤细胞释放产生，直径约1-10um
  • 其他各种EV亚群
• 提取方法
  • 差速离心
    • 细胞培养上清中外泌体、4℃
      • 低速离心以除去细胞成分，300g离心10min。收集上清
      • 低速离心去除死细胞，2000g离心10min。收集上清
      • 高速离心以消除细胞碎片，10000g离心70min。收集上清
      • 高速离心以沉淀外泌体。100000g离心70min。收集沉淀
      • 泌体重悬于适量PBS中，消除污染蛋白质， 100000g离心70min。收集沉淀
      • 分装外泌体悬液，-80℃保存，避免反复冻融
  • 密度梯度离心
    • 优点
      • 密度梯度离心可以被认为是超速离心的高级版本，可以获得高纯度的外泌体
    • 缺点
      • 这种方法很麻烦并且产量相对较低
  • 超滤法
    • 超滤法适用于细胞上清的提取，一般需要 200ml 培养基，适用于纯化大量外泌体。最常见的过滤膜有孔径 0.8 微米， 0.45 微米或 0.22 微米，可用于收集大于 800 纳米， 400 纳米或 200 纳米的外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性
      • 步骤
        • 低速离心以除去细胞成分， 500g 离心 10min 。收集上清
        • 使用 0.22 微米过滤器过滤细胞碎片以及大囊泡。收集滤液
        • 将滤液转移至装有超滤膜的超滤仪，氮气加压过滤。收集滤液
        • 将过滤后悬液转移至离心管，100000g离心40min。收集沉淀
        • 外泌体重悬于适量培养基中。使用0.22微米过滤器过滤 , 分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融
        • 子主题
    • 优点
      • 超速离心是最常见的技术，也是外泌体分离的金标准，是最简单的分离技术之一，它使外泌体通过不同分子量截止的过滤膜
  • 体积排阻色谱
    • 类似于超滤
  • 化学沉淀化学沉淀
    • 优点
      • 蛋白质凝固，操作简单
    • 缺点
      • 所得的外泌体纯度低，常含有大分子蛋白质杂质，不利于外泌体的蛋白质组学分析
  • 试剂盒法
    • 试剂盒法适用于细胞上清，一般需要 50-100ml 培养基。该试剂盒使用容易和快速，耗时短
      • 低速离心以除去细胞成分，3000g离心10min。收集上清
      • 将滤液转移至离心管，加入试剂
      • 上下颠倒混匀
      • 1500g离心30min，管底可见沉淀，小心弃去上清
      • 1500g离心10min，小心弃去上清
      • 外泌体重悬于适量培养基中。使用0.22微米过滤器过滤 , 分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融。
  • 免疫亲和捕获
    • 优点
      • 抗原-抗体特异性反应。通过该方法获得的外泌体具有高纯度
    • 缺点
      • 活性低
  • 微流控芯片
    • 优点
      • 根据物理和生化特性分离外泌体，该方法具有速度快、通量高、特异性强等特点，它可以从大量临床样本中快速检测外泌体，是一种具有临床应用前景的新型诊断技术。
  • 展望
    • 不同的分离和纯化方法各有优缺点，但没有技术可以将外泌体分离到绝对纯度，除了开发新技术外，上述技术的组合应用可能有助于克服个别技术的缺点，并在不损害外泌体生物活性的情况下尽可能考虑产量和纯度。随着外泌体分离纯化技术的不断发展，纳米技术和微流控芯片的应用可以优化外泌体的研究。标准化和新的外泌体分离方案有助于提高外泌体研究的一致性，外泌体在眼科领域的应用将继续扩大
• 研究进展
  • https://www.univ-bio.com/study-center/article-detail.html?id=248&sourceType=SEM-baidu
    • 外泌体与聚糖
      • 京都大学 在Small Methods杂志（IF 14.188）“Assessment of Surface Glycan Diversity on Extracellular Vesicles by Lectin Microarray and Glycoengineering Strategies for Drug Delivery Applications” 报道了不同细胞、不同EV亚群的表面聚糖的特征，并对EVs表面聚糖进行修改后发现，不同的聚糖形式会影响EV的细胞摄取和体内生物分布。
    • 外泌体与核酸
      • 第二军医大学附属长海医院 Molecular Cancer杂志上题为“Circulating exosomal mRNA profiling identifies novel signatures for the detection of prostate cancer”。 王富博、杨波 前列腺癌相关的emRNA进行了全面测序，开发并建立了用于前列腺癌早期诊断的新型emRNA的特征
    • 外泌体与蛋白质
      • 哈佛医学院 Cell Reports杂志“Tissue differences in the exosomal/small extracellular vesicle proteome and their potential as indicators of altered tissue metabolism 对参与代谢疾病的一些细胞系的sEV蛋白质组进行比较，识别出一系列独特sEV标志物，并证明这些标志物可以帮助预测血清 sEV的起源组织。
      • 外泌体与脂质
        • 澳大利亚拉筹伯大学（La Trobe University） Eur J Cancer杂志（IF=6.163）“Molecular lipid species in urinary exosomes as potential prostate cancer biomarkers” 研究了脂质在尿液外泌体中作为前列腺癌生物标志物的潜在用途。