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发酵技术与微生物培养
微生物发酵即是指利用微生物,在适宜的条件下,将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。发酵技术与微生物的培养、应用这部分知识是生物的重要内容,下面予以总结和分析,以帮助同学们掌握。
编辑于2019-04-06 10:31:32- 发酵技术
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发酵技术与微生物培养
微生物培养
培养基
定义
人们按微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质
分类
物理性质
固体培养基
加凝固剂
可以是琼脂、硅胶 不能被微生物利用，只有凝固作用
用于微生物的鉴定、分离、保藏
半固体培养基
加凝固剂
微生物的运动、分离
液体培养基
不加凝固剂
用于工业生产
化学成分
天然培养基
合成培养基
用途
选择培养基
培养分离出特定微生物
鉴别培养基
鉴别不同种类微生物
配方
碳源、氮源、水、无机盐
PH 、特殊营养物质、氧气
培养乳酸菌要添加维生素 培养霉菌要将PH调至酸性 培养细菌要将PH调至中性或微碱性 培养厌氧微生物提供无氧条件
无菌技术
目的
避免杂菌污染
消毒
巴氏消毒
70～75℃煮30min 80℃煮15min
用于牛奶、啤酒等不宜高温灭菌的液体
煮沸消毒
100℃煮5～6min
日常食品，罐装食品
紫外线消毒
30W紫外线灯照射30min
接种室、接种箱、超净工作台
化学药剂消毒
70%酒精、碘酒涂抹，
皮肤、伤口、空气、手术器械等
氯气
水源消毒
杀菌
灼烧灭菌
接种环、接种针、管口瓶、瓶口等
干热灭菌
160~170℃ 1~2h
玻璃器皿、耐高温金属用具
高压蒸汽灭菌
100kp 121℃高压蒸汽灭菌锅15~30 min
培养基
操作
计算
称量
牛肉膏比较粘稠，用玻棒挑取 牛肉膏和蛋白胨易吸潮，要动作迅速，及时盖上瓶盖
融化
牛肉膏与称量纸一同放入烧杯，加水加热， 牛肉膏融化后用玻棒挑取称量纸
加琼脂，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底导致烧杯破裂
灭菌
培养基放入高压蒸汽灭菌锅
培养皿放入干热灭菌箱
倒平板
冷却至50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板
左手拔棉塞
灼烧瓶口
打开一条稍大于瓶口的缝隙（10～20ml）倒入培养基，盖上皿盖
冷却凝固，倒置
防止皿盖上的水珠落入培养基 培养基表面水分蒸发过快
纯化
平板划线法
对混合菌进行分离 可观察菌落特征
原理
接种环在琼脂固体培养基表面进行划线操作 将聚集的菌种逐步分散到培养基表面 数次划线培养后可以分离到由一个菌落繁殖而来的子细胞群（菌落）
注意事项
第一步操作前要灼烧
避免接种环上可能的微生物污染培养基
之后每次都要灼烧
杀死上次残留的菌种 保证下次划线时菌种来自上次划线末端
每次划线结束要灼烧
及时杀死接种环上残留菌种，避免细菌污染环境，感染操作者
灼烧后要冷却后再划线
避免接种环温度过高，杀死菌种
每次划线从上次末端开始
聚集菌种逐步稀释，以便获单个菌落
不要划破培养基
划破会使划线不均匀，难以实现单菌落分离 存留在划破处单个细胞，无法形成规矩菌落
稀释涂布平板法
可计数，观察菌落特征
原理
対菌液进行梯度稀释，不同稀释度菌液进行涂布 稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的生物被分散成单个细胞 在培养基表面形成菌落
保存
临时保藏
试管固体斜面培养基
4℃ 每3～6个月转移一次
甘油管藏
甘油瓶
-20℃
无菌检查
尿素分解菌的分离与计数
筛选
原理
寻找目的菌是根据它对生存环境的要求到相应环境中寻找
人为提供有利于目的菌生长的条件同时抑制或阻止其他微生物生长
选择培养基原理
允许特定种类微生物生长抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基
注意事项
选取30～300平板进行计数
统计菌落往往比实际活菌低
两个或多个活菌连在一起，平板上只是一个菌落
每克样品中菌株数＝（ C÷V）×M
计数
原理
样品稀释度足够高的培养基表面生长的一个菌落里，来源于样品稀释液中一个菌落
注意事项
选取30~300菌落进行计数
统计菌落数目往往比实际菌落数要低
当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
设置对照
目的
排除实验组中非测试因素对实验结果的影响
计数方法
直接计数
间接计数
注意事项
土壤取样
土壤微生物中70%～90%为细菌
土壤接近中性或微碱性
距离地表3~8cm
样品稀释
细菌10
放线菌10³
真菌10²、10³、10
微生物观察与培养
细菌在30～37℃培养1～2天
放线菌25～28℃培养5～7天
霉菌在25~28℃培养3～4天
无菌操作
小铁铲与信封都要灭菌
火焰旁称取土壤
稀释的每一步都在火焰旁进行
做好标记
标记好培养时间、培养基种类、培养日期、稀释度
检验
细菌合成的脲酶尿素分解成氨，使培养基碱性增强
酚红指示剂在碱性条件下会变红
纤维素分解菌的分离
基础知识
棉花是自然界纤维素含量最高的
木材、作物秸秆也含纤维素
纤维素分解酶
复合酶，组成为C
作用
C 、C 将纤维素分解为纤维二糖
葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖
筛选
刚果红染色剂
原理
刚果红可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物 纤维素被分解后，刚果红-纤维素复合物无法形成 培养基会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
实验设计
土壤取样
原理 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素环境中
子主题
树林中腐殖土，多年积累枯枝败叶
将滤纸等富含纤维素的物质埋在土壤中， 30天左右从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌
选择培养
目的
通过选择培养基增加纤维素分解菌数量
液体培养基
刚果红染色
方法一
长出菌落的培养基上，覆盖CR溶液 10～15min倒去CR溶液 加入NaCI，15min后倒掉
方法二
灭菌后,加入CR混合均匀后倒平板
检验
发酵产纤维素酶实验
液体发酵
固体发酵
发酵技术
果酒的制作
原理
酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，分解葡萄糖产生酒精
真菌，真核生物，异养兼性厌氧型，有核膜包被的细胞核
条件
18~25℃、缺氧、酸性
起作用的为附着在葡萄皮上的野生型酵母菌
酸性、缺氧条件，酵母菌生长，多数细菌无法生存
葡萄酒深红色原因
红葡萄皮的色素进入发酵液中
操作
新鲜葡萄先冲洗再除去枝梗
不要过度冲洗，防止菌种流失
榨汁机洗净晾干，发酵瓶用70%酒精消毒
装瓶后封闭充气口
注意事项
装瓶后留有1/3的空间
温度为18～25℃时间为10~12天
每隔12h将瓶盖拧松一次，随后将瓶盖拧紧
防止进入O ,继续酒精发酵
酒精发酵产生CO ,瓶盖拧松以放出CO
检验原理
酸性高锰酸钾与酒精反应呈灰绿色
果醋的制作
原理
醋酸菌在氧气和糖原充足时将糖原分解为醋酸
醋酸菌在氧气充足，糖原缺乏时将乙醇变为乙醛，将乙醛变为醋酸
变酸的酒表面有菌膜就是醋酸菌大量繁殖形成
细菌，原核生物，异养需氧型，无成形核膜包被
条件
30～35℃、酸性、有氧
操作
瓶盖打开，盖上一层纱布
制造有氧环境，进行醋酸发酵
温度30～35℃ 时间7-8天
腐乳的制作
原理
毛霉参与发酵
丝状真菌，还有曲霉、根霉、酵母菌等
毛霉产生的蛋白酶将蛋白质分解为小分子的多肽和氨基酸，脂肪酶将脂肪分解为甘油和脂肪酸
过程
毛霉的生长
条件
15～18℃ 保持一定湿度
5天后豆腐表面布满菌丝
空气中的毛霉孢子，现代采用无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上
加盐腌制
豆腐块分层摆放在瓶中，逐层加盐，随层数加高增加盐量，接近瓶口要铺厚一些
越接近瓶口，被杂菌污染的可能性越大
作用
加盐析出豆腐中的水分，使豆腐变硬 抑制微生物的生长，避免豆腐的腐败
盐浓度过低不足以抑制微生物生长，易导致豆腐腐败盐浓度过高，影响腐乳口味
配置卤汤
酒
含量为12% 可抑制微生物生长
含量过高腐乳成熟时间延长，含量过低不足以抑制微生物生长，使豆腐腐败
香辛料
使腐乳有独特风味，防腐杀菌
密封腌制
泡菜的制作及亚硝酸盐含量的测定
基础知识
乳酸菌发酵
乳酸菌无氧呼吸，分解葡萄糖，产生乳酸
细菌，原核生物，异养厌氧型
亚硝酸盐
白色粉末，易溶于水，分布广泛
蔬菜 4mg/kg 咸菜 7mg/kg 豆粉 10mg/kg
一般不会危害健康
摄入总量0.3~0.5g引起中毒 摄入总量3 g时引起死亡 肉制品不能超过30mg/kg 酱腌菜20mg/kg 婴儿奶粉2mg/kg
特定条件下转化成亚硝胺，有致癌作用
泡菜制作
清水与盐的质量比4：1配置盐水
调味，抑制微生物生长
煮沸冷却
煮沸
消毒
冷却
不影响乳酸菌生命活动
蔬菜装至半坛放入香辛料，装至八成满
注入配置好的盐水，使盐水没过全部菜料
盖好坛盖，坛盖边缘水槽注满水
保证坛内乳酸菌发酵所需无氧环境
测定亚硝酸盐含量
原理
酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红染色剂
操作
泡菜坛选择
选火候好，无裂纹，无砂眼的泡菜坛，不合格的泡菜坛易引起泡菜腐烂，将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水
条件
腌制10天
发酵时间过长，会产生其他有害物质，乳酸含量过高，影响口味
测定亚硝酸盐
配置溶液
对氨基苯磺酸溶解于20%盐酸溶液
N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶于水
氯化铬与氯化钡溶于蒸馏水，浓盐酸调至PH为1
增加亚硝酸盐溶解度
氢氧化铝乳液和氢氧化钠
除去滤液中色素和杂志，使其变得无色透明
中和过多盐酸
制备标准显色液
空白对照
对氨基苯磺酸与N-1-萘基乙二胺盐酸盐混合
制备样品处理液
比色