液相色谱

液相色谱原理及注意事项，帮助快速了解液相色谱。

液相色谱（用于分析沸点高或加热易分解的物质）

• 功能分类
  • 分析液相
    • 可用于分析沸点高，加热易分解的物质
    • 进样系统-泵
      • 把流动相连续、稳定的注入系统
        • 二元泵
          • 两种溶剂
          • 两个泵头
          • 泵后混合
          • 精度高
        • 四元泵
          • 四种溶剂
          • 一个泵头（四元比例阀）
          • 泵前混合
          • 精度稍差
    • 进样器-流动相
      • 将液体样品引入系统
        • 不挥发性流动相
          • 磷酸钾
          • 磷酸钠
          • 醋酸钠
          • 醋酸钾
        • 挥发性流动相
          • 醋酸铵
          • 甲酸铵
          • 三氟乙酸
    • 色谱柱
      • 柱长越长，柱效越高；柱长越短，分离越快；柱越窄，色谱峰越窄
      • 用于样品分离
        • 根据填料种类分类
          • 薄壳填料（玻璃珠表面填硅胶）
            • 固定相容量小，可分离低浓度样品
            • 减少涡流扩散项，柱效增加
          • 全多孔球形硅胶（多孔球形硅胶填充）
            • 粒径越小，柱效越高，同时阻力增大，所以需要在高压下运行
            • 常用的（250mm、4.6mm）5um柱就是全多孔硅胶柱
          • 核壳柱（以硅胶核为中心）
            • 优点
              • 填料大小均匀，具有更低的涡流扩散
              • 填料孔体积越小，纵向分子扩散越小，传质阻力越小
        • 制备过程
          • 聚合
          • 煅烧
            • Si-O-Si
          • 活化
            • Si-OH
          • 键合
            • Si-C18
              • 此步键合上功能基团
          • 封端
            • Si-O-CH3
              • 封端的目的：键合的C18空间位阻大，不是所有的活化基团都能键合上C18，裸露的Si-OH呈酸性，易与碱性物质反应，造成色谱峰拖尾或者不出峰
              • 也有例外，如果采用强酸性流动相推荐不封端
          • 填充
            • 如填充不好会造成柱头塌陷，导致色谱峰扩散
            • 压力
            • 填充数量
        • 常见问题
          • 硅胶柱耐酸不耐碱（重用pH为2-8）
            • 改进
              • 改用聚合物
                • 大分子结构捕获
              • 采用无机有机杂化技术
                • Si-C键代替部分Si-O键，不易断裂，pH耐受范围扩大为1-12
    • 检测器
      • 化学信号转化为电信号
        • 紫外检测器（UV）
          • 样品经紫外光照射产生特征吸光度后经光电二极管转化为电信号
          • 最大吸收波长选择
            • 应避开流动相干扰，应避开溶剂的截止波长20 nm以上
          • 因检测原理需严格控制气泡引入
            • 流动相排气泡
            • 在出口处加背压管
        • 示差折光检测器（RID）
          • 利用折光效应，折光与化合物的密度有关。该检测器通用性好，但灵敏度不高
            • 化合物密度可能比流动相密度大或小，正负峰都会出现
            • 密度受温度影响大，需要注意保温
            • 不同流动相比例会出现密度的变化，导致基线波动。所以不能采用梯度洗脱，只能采用等度洗脱
        • 荧光检测器（FLD）
          • 利用荧光特性，检测具有荧光的化合物。灵敏度高
            • 氧气具有荧光猝灭响应，使峰面积减小。所以流动相需要严格脱气
        • 蒸发光散射检测器（ELSD）
          • 利用光散射效应，空气中颗粒越多，散射越明显。适用于分子量大的化合物
            • 流动相需采用可挥发性物质，经过雾化气去除流动相溶剂，使化合物形成悬浮颗粒
  • 制备液相
    • 可用于分离纯化
• 模式分类
  • 相似相溶原理
  • 正相色谱
    • 色谱柱中固定相极性大于流动相极性，弱极性物质出峰快
  • 反相色谱
    • 色谱柱中固定相极性小于流动相极性，极性物质出峰快
  • 亲水作用色谱（HiLiC模式）
    • 主要用来分析糖类。选择正相色谱中强极性固定相和反相色谱中强极性流动相
  • 离子对色谱（离子交换色谱）
    • 适用于化合物极性特别强，易电离的物质
  • 凝胶色谱（体积排阻色谱）
    • 出峰与化合物体积有关，体积越大，出峰越快