蛋白质知识点总结

蛋白质是大分子物质，是人体的组成部分。下图为生物化学蛋白质知识点总结。

蛋白质

• 蛋白质组成、功能与分类
  • 蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的生物大分子。
  • 元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外， 还有氮和少量的硫。
    • 凯氏定氮法
      • 蛋白质含量=蛋白氮乘以6.25 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）
  • 分子组成：a-氨基酸
  • 功能
    • 1、蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物 体最基本的结构物质和功能物质。 2、蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。 3、在细胞结构、生物催化、物质传输、运动、防御、调控以及记忆、识别等各方面都起着极其重要的作用。
  • 分类
    • 组成
      • 简单蛋白质：仅由氨基酸组成的肽链
      • 组成蛋白质：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成
• 蛋白质的水解
  • 1、6mol/L的盐酸或4mol/L硫酸在105～110℃条件下进行水解，反应时间约20h
    • 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化，得到的是L-氨基酸。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。
  • 2、一般用5 mol/LNaOH煮沸10～20h
    • 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。
  • 3、蛋白酶水解
    • 最常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶(Trypsin) 、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)。
• 氨基酸
  • 氨基酸是蛋白质的基本结构单元
  • 必需氨基酸：人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸
    • Ile Met Lys Val Leu Trp Phe Thr 一 家 来 写 两 三 本 书
  • （1）非极性R基团氨基酸：8种—Ala Val Leu Ile Phe Pro Met Trp (2)极性不带电荷R基团氨基酸：7种—Ser Thr Asn Gln Try Cys Gly (3)带负电荷R基团氨基酸：2种—Asp Glu (4)带正电荷R基团氨基酸：3种—Lys Arg His 硒代半胱氨酸：HSe-CH2-CH-COOH
  • 理化性质
    • 一般物理性质
      • 氨基酸的光吸收
        • 近紫外区(220～300nm)只有Tyr、Phe和Trp有吸收光的能力。 Tyr的umax＝275nm Phe的umax＝257nm Trp的umax＝280nm
      • 氨基酸的旋光性（除除Gly外，氨基酸含有一个手性α-碳原子，因此都具有旋光性。）
      • 高熔点
      • 一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。
      • 氨基酸一般有味
    • 氨基酸的两性性质和等电点
      • 1.氨基酸的兼性离子形式
      • 2.氨基酸的两性解离
        • 等电点：在某一PH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时的溶液pH称该氨基酸的等电点。
      • 组氨酸含有咪挫基，PK2值为6，在生理条件下具有缓冲作用。组氨酸残基在活性蛋白中常为活性中心。
    • 氨基酸的化学反应
      • 1、茚三酮反应
        • 常用于氨基酸的定性或定量分析（脯氨酸是亮黄色，其余氨基酸是紫红色。
      • 2、成肽反应
        • 是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。
      • 3、与2、4-二硝基氟苯反应
        • 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.亦称Sanger反应
      • 4、与苯异硫氰酸酯反应
        • 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸，分析肽段序列最好方法。亦称Edman反应
      • 5、与丹磺酰氯反应
        • 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸
      • 6．侧链基团的化学性质
  • 氨基酸的分离和测定
    • 一）色谱法（层析法）
      • 利用混合物中各组分物理化学性质不同（吸附力，分子形状及大小，分子亲和力、分配系数等。）
        • 1) 离子交换层析
          • 利用不同组分对离子交换剂的亲和力不同
            • ①Anion exchange resin一能交换阴离子
            • ②Cation exchange resin-能交换阳离子
        • 2）分配层析分离
          • 不同组分的分配系数不同
        • 3）凝胶层析
          • 利用不同组分的分子大小不同
        • 4）吸附层析
          • 吸附剂对不同组分的吸附性能不同
    • 二) Electrophoresis(电泳)
      • 利用分子携带的净电荷不同
        • pH> pI时, Aa带负电荷, 在电场中向正极移动; pH<pI时，Aa带正电荷，在电场中向负极移动。
      • 另一个是阻碍质点前进的力或摩擦力，其大小与介质的性质、质点的大小、形状和运动速度有关。
• 肽
  • 一个Aa的羧基与另一个Aa的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键(Peptide bond)，所形成的化合物称为肽(Peptide) 。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基（Amino acid residues）。
    • 二面角Dihedral angel ：C2α-N1单键的旋转角度用Φ表示。C2α-C2单键的旋转角度用Ψ表示。 由于Φ和Ψ这2个构象角决定了相邻2个肽平面在空间上的相对位置，叫二面角。
    • 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为结束的排列顺序。
  • 理化性质
    • 1. 每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。 2. 在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离的基团。 3. 每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。 4. 原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优 势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。
    • 化学反应
      • 茚三酮反应
      • Sanger反应
      • DNS反应
      • Edman反应
        • 
      • 双缩脲反应
        • 必须有两个及以上的肽键才能反应
          • 紫红色或者蓝紫色络合物
  • 多肽的合成
    • 生物合成的多肽是N端到C端 而化学合成是C端到N端
• 蛋白质结构与理化性质
  • 蛋白质的结构
    • 一级结构
      • 多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置
      • 一级结构测定
        • 多肽链断裂
          • 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理， 即可分开多肽链
        • 二硫键
          • 断裂
            • 可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的α-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，
          • 确定位置
            • 采用胃蛋白酶水解，切点多，且二硫键稳定。
            • 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离
        • 肽链的断裂
          • 酶解法
            • 胰蛋白酶
              • 专一性强。只水解Lys和Arg。
            • 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）
            • 胃蛋白酶
            • 嗜热菌蛋白酶
            • 羧肽酶
            • 氨肽酶
          • 化学法（获得较大的肽片段）
            • 羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。
            • 溴化氰:它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键
        • 测序
          • N端测定
            • sanger法（2，4-二硝基氟苯（DNFB））
            • edman法（苯异硫氰酸酯）
              • 能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。
              • 是分析肽段序列最好方法
            • 丹磺酰氯法
              • 具有较强的荧光性
            • 氨肽酶法
          • C端测定
            • 肼解法
            • 羧肽酶法
              • 羧肽酶A能水解除了Lys、Arg和Pro以外的C端氨基酸残基。
              • 羧肽酶B只能水解Arg和Lys为C端的多肽
      • 一级结构与功能
        • 同源蛋白质（Homologous protein）:指进化上相关的一组蛋白质。它们常在不同物种中执行着相同的生物学功能。
        • 一级结构的变异与分子病
          • 镰刀状细胞贫血病
            • 病因：血红蛋白AA顺序的发生了细微变化 正常人 HbA—bn6Glu 病人 HbS—bn6Val
    • 二级结构
      • 指多肽链的主链本身在空间的排列或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。稳定二级结构的主要作用力是氢键。
        • a-螺旋
          • 3.6（13）螺旋
        • β-转角
        • β-折叠
        • 无规则卷曲
      • 超二级结构
        • 指蛋白质中相邻的二级结构单位（a-螺旋或b-折叠或b-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。或者指几个二级结构及其连接的特别稳定的排列，是构成三级结构的元件。超二级结构的基本类型：aa、bab、bbb
      • 模体
    • 三级结构
      • 蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。
        • 氢键 范德华力 疏水键（疏水相互作用）它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力 离子键（盐键） 二硫键
    • 四级结构
      • 四级结构是指由两 个或两个以上具有三级结构的亚基(Subunit)按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。
        • 蛋白质的四级结构实际上研究亚基之间的相互作用、空间排布及亚基接触部位的空间布局。
        • 测定亚基的相对分子质量方法常用SDS（十二烷基硫酸钠）-PAGE
  • 蛋白质理化性质
    • 蛋白质的两性离解和电泳现象
      • 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动
        • 1. PAGE：分离原理依据蛋白质大小和形状﹑所带电荷的差异
        • 2. SDS-PAGE(变性电泳)
        • 3. 等电聚焦（Isoelectric focusing,IEF)
    • 蛋白质的胶体性质
      • 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去
      • 胶体系统稳定的原因
        • 一是蛋白质表面形成水化层；
        • 二是蛋白质表面具有同性电荷
    • 蛋白质的沉淀作用
      • 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法
        • 盐析:是指在蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。
          • 一方面与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜；另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出
        • 盐溶:加入少量的中性盐，如硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大
      • 不可逆沉淀：由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀
    • 蛋白质的变性
      • 天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化
        • 因素：温度（热、冷） 强酸、强碱 尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应） 表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）
      • 当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性
    • 蛋白质的紫外吸收
      • Phe、Tyr和Trp在280nm 附近有最大吸收
    • 蛋白质定量测定
      • 双缩脲反应
      • 酚试剂反应（Tyr的酚基将福林试剂还原）
      • 考马斯亮蓝反应（染料结合法）
      • 凯氏定氮法
      • 紫外线测定法
  • 蛋白质纯度鉴定
    • 1. SDS-PAGE 2. PAGE 3. IEF 4. HPLC 5. Analysis of N-terminal AA 6. Other methods
• 蛋白质大分子的制备