人教版生物学选必三.生物技术与工程

这是一篇关于生物技术与工程的思维导图，涵盖了生物技术与工程领域的多个重要方面。介绍了发酵工程的基本概念、原理和应用。讲述了从传统发酵技术到发酵工程的演变过程， 微生物的培养技术、选择培养和计数方法，以及发酵工程在食品、医药等领域的应用。详述了重组DNA技术的基本工具、基因工程的基本操作程序，以及基因工程在农业、医药等领域的应用。

生物技术与工程

• 发酵工程
  • 传统发酵技术
  • 微生物的实验室培养
    • 微生物的纯培养
      • 流程
      • 培养基的配置
        • 分类
        • 营养组成
          • 各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求
        • 配置原则
          • (1)目的要明确；(2)营养要协调；(3)理化适宜： pH、渗透压等；(4)经济节约
        • 过程
          • 计算、称量
          • 融化
            • 融化混匀后，用pH仪调pH并分装到锥形瓶中
          • 灭菌
            • 用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌
          • 倒平板
            • ①培养基冷却至50℃左右开始倒平板 ②皿盖不能完全打开，也不能放在桌面上 ③待培养基凝固后将平板倒置(防止冷凝水滴落，污染培养基) ④该过程在酒精灯火焰附近进行(酒精灯火焰附近存在着无菌区域)
      • 无菌培养技术
        • 关键
          • 防止外来微生物的污染
        • 目的
          • 防止污染培养物，防止污染环境，防止污染操作者
        • 消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物 灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
        • 注意事项
          • 巴氏消毒法与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点：在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 紫外线消毒的原理是：紫外线破坏DNA结构，在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果 使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是：未将锅内冷空气排尽
        • 检验灭菌是否彻底
          • 将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养
      • 菌种的保藏
        • 短期保藏：固体斜面培养基；长期保藏：甘油管藏法
      • 接种
        • 平板划线法
          • 用途
            • 可用于分离单菌落
          • 注意事项
            • ①一般来说，平板划线法划线5次，接种环需灼烧6次，其中，第一次灼烧是为了避免接种环上的杂菌污染培养物，第六次灼烧是为了避免接种环上微生物污染环境，中间四次灼烧是为了稀释分离单菌落 ②每次划线应该从上一次划线的末端开始，便于分离单菌落
        • 稀释涂布平板法
          • 用途
            • 可用于分离单菌落以及微生物的计数
          • 注意事项
            • ①主要操作环节：系列稀释和涂布平板。 ②稀释涂布平板法通过梯度稀释分离单菌落 ③利用稀释涂布平板法计数时，应选取每个平板的菌落数在30-300个的平板进行计数 ④每个稀释梯度至少接种3个平板
      • 培养
        • 不同微生物的最适温度和最适pH等不相同，所以不同微生物的培养条件不同
      • 观察和计数
        • 观察
          • 在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，如形状、大小、颜色、隆起程度等
        • 计数
          • 稀释涂布平板法
            • 注意事项
              • ①通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得的菌落数为30-300，适于计数的平板 ②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值 ③稀释涂布平板法统计的菌落数往往比实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
          • 显微镜直接计数法
            • 优点
              • 计数方便，操作简单，比较接近真实值
    • 微生物的选择培养
      • ①对于需要计数的微生物，直接对采集的菌种进行稀释涂布平板法接种培养。 ②对于不需要计数，只需要筛选的微生物，可先对采集的菌种用液体的选择培养基进行富集培养后再用稀释涂布平板法筛选单菌落
      • 微生物的选择培养的选择方法
        • ①利用微生物的营养特点进行选择培养，如：利用以尿素为唯一氮源的培养基筛选尿素分解菌 ②利用某种化学物质进行的选择培养，如：在培养基中加入青霉素筛选抗青霉素的微生物 ③利用培养条件进行的选择培养，如：在高温条件在培养得到耐高温的微生物
      • 微生物的鉴别方法
        • ①培养基无色，菌落周围显色。如：用酚红指示剂鉴别尿素分解菌，尿素分解菌周围呈红色 ②培养基有颜色，菌落周围出现透明圈。如：用刚果红鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌周围出现透明圈 ③菌落变色。如：用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌，大肠杆菌呈黑色
  • 发酵工程
    • 基本环节
      • ①选育菌种
        • 性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得
      • ②扩大培养
        • 发酵罐的体积一般都比较大，所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养
      • ③配置培养基
        • 在菌种确定之后，要选择原料制备培养基，培养基的配方要经过反复试验才能确定
      • ④灭菌
        • 培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌
      • ⑤接种
      • ⑥发酵罐中发酵
        • 这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必须的营养组分，要严格控制温度、pH、和溶解氧等发酵条件。环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成
      • ⑦分离、提纯产物
    • 应用
      • ①在食品工业上的应用
        • 生产传统发酵产品、食品添加剂、酶制剂等
          • 啤酒的工业化生产：发芽→焙烤→碾磨→糖化→蒸煮→发酵→消毒→终止
            • ①发芽：大麦种子发芽，释放淀粉酶 ②焙烤：加热杀死种子胚，但不使淀粉酶失活 ③碾磨：将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉 ④糖化：淀粉分解，形成糖浆 ⑤蒸煮：产生风味组分，终止酶的进一步作业，并对糖浆灭菌 ⑥发酵：酵母菌将糖转化为酒精和CO2 ⑦消毒：杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期 ⑧终止：过滤、调节、分装啤酒进行出售
      • ②在医药工业上的应用
        • 生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等
      • ③在农牧业上的应用
        • 生产微生物肥料（利用微生物代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植物生长）、微生物农药（利用微生物或其代谢物来防治病虫害）、微生物饲料等
      • ④在其他方面的应用
        • 利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质；利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂；利用嗜低温菌提高热敏性产品的产量等
• 植物细胞工程
  • 植物组织培养技术
    • 概念
      • 植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术
    • 原理
      • 植物细胞的全能性
    • 过程
      • (1)外植体的消毒：将流水冲洗后的外植体用酒精消毒30 s，用无菌水清洗2～3次后，再用次氯酸钠溶液处理30 min，用无菌水清洗2～3次。 (2)外植体的分割：用无菌滤纸吸去表面的水分，用解剖刀将外植体切成0.5～1 cm长的小段 (3)接种：在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。 (4)培养：将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22 ℃的培养箱中培养。定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 (5)转移培养：将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。 (6)移栽：将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩上，壮苗后再移栽入土。
    • 相关概念
      • ①外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞 ②脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程 ③愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团 ④再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程
    • 注意事项
      • ①外植体一般选择植物的花和幼嫩的组织，脱分化相对比较容易 ②植物组织培养成功的关键是避免微生物的污染，所有实验用具要严格灭菌，接种过程要进行严格的无菌操作。 ③脱分化时避光培养；再分化形成芽和叶时，光照有利于叶片内叶绿素的合成 ④激素的作用：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素生长素/细胞分裂素比值适中时诱导愈伤组织的形成，比值大时诱导根的分化，比值小时诱导芽的分化
    • 培养箱
      • 恒温培养箱
    • 生殖方式
      • 无性繁殖
    • 细胞增殖方式
      • 有丝分裂
    • 结果
      • 获得新个体或细胞产物
    • 优点
      • 利用体细胞进行组织培养，可以保留亲本的优良性状
  • 植物体细胞杂交技术
    • 概念
      • 植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术
    • 原理
      • 细胞膜的流动性，植物细胞的全能性
    • 过程
      • (1)去壁：用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体。 (2)诱导原生质体融合 方法： ①物理法：电融合法、离心法等。 ②化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋－高pH融合法等。 融合完成的标志：再生出细胞壁 (3)杂交细胞培养，得到杂种植株
    • 关键
      • 原生质体的融合
    • 结果
      • 融合后得到的杂种细胞再经过诱导可形成愈伤组织，并可进一步发育成完整的杂种植株
    • 优点
      • 打破远缘杂交不亲和的障碍
  • 应用
    • 植物繁殖的新途径
      • 快速繁殖（也叫微型繁殖技术）
        • 优点
          • ①无性繁殖，保持优良品种的遗传特性； ②高效、快速地实现种苗的大量繁殖； ③可实现工厂化生产
      • 脱毒苗
        • 选材部位
          • 植物的分生区附近
            • 分生区附近的病毒极少，甚至无病毒
    • 作物新品种的培育
      • 单倍体育种
        • 原理
          • 染色体组数减少
        • 流程
        • 优点
          • 后代都是纯合子，能稳定遗传；明显缩短了育种年限，节约了大量的人力物力
      • 突变体的应用
        • 原理
          • 基因突变
        • 流程
        • 利用
          • 筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种
        • 优点
          • 提高愈伤组织的突变率，获得新品种，加快育种进程
    • 细胞产物的工厂化生产
      • 植物细胞培养
        • 指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术
      • 过程
      • 优点
        • 提高生产速度、便于操作管理
• 动物细胞工程
  • 动物细胞培养技术
    • 概念
      • 从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
    • 原理
      • 细胞增殖
    • 过程
    • 培养条件
      • 无菌、无毒的环境 营养（糖类、氨基酸、无机盐、维生素，动物血清或血浆等） 温度和pH 气体环境（95%的空气+5%的CO2）
    • 培养箱
      • CO2培养箱
    • 选材
      • 一般取自幼龄动物的器官或组织，因为这些组织或器官的生命力旺盛，分裂能力强
    • 注意事项
      • ①原代培养≠第一次增殖，原代培养指指动物组织经处理后的初次培养。 ②细胞贴壁：多数细胞贴附在瓶壁上生长。与细胞膜上的糖蛋白有关 ③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂生长的现象称为细胞的接触抑制 ④动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。 ⑤用酶两次处理的目的：第一次使用的目的是使组织细胞分散开；第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分散后继续培养。 ⑥使细胞分散开的原因：一是能保证细胞所需要的营养供应；二是能保证细胞内有害代谢产物的及时排出 ⑦不能用胃蛋白酶处理，因为胃蛋白酶和细胞生长的最适pH不同 ⑧癌细胞细胞膜上糖蛋白减少，细胞的黏着性降低，在适宜的条件下可以无限增殖，因此培养的癌细胞无接触抑制现象，在培养瓶中能够生长成多层。
    • 结果
      • 获得大量的动物细胞或细胞产物
    • 应用
      • 干细胞的应用（胚胎干细胞CS、成体干细胞、诱导多功能干细胞iPS）
        • 功能
          • 在一定条件下，可以分化成其他类型的细胞
        • 分类
  • 动物细胞融合技术
    • 定义
      • 动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
    • 原理
      • 细胞膜的流动性，细胞增殖
    • 诱导融合的方法
      • PEG融合法，电融合法和灭活病毒诱导法等
    • 融合完成的标志
      • 细胞核完成融合
    • 结果
      • 形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点
    • 优点
      • 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
    • 应用：单克隆抗体的制备
      • 过程
      • 注意事项
        • ①给小鼠注射抗原是为了得到能产生特定抗体的B淋巴细胞 ②杂交瘤细胞的特点：既能无限增值，又能产生大量特定抗体 ③第一次筛选：用特定的选择培养基（HAT培养基）进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 ④第二次筛选：用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群 ⑤单克隆抗体是指由杂交瘤细胞分泌的抗体 ⑥单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，能大量制备
  • 动物细胞核移植技术
    • 定义
      • 动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术
    • 原理
      • 动物细胞核具有全能性
    • 过程
    • 注意事项
      • ① 生殖方式：无性生殖（克隆动物） ② 供体：一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。 ③ 受体：选择MⅡ期的卵母细胞，其原因是： a. 卵母细胞的细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。 b. 卵母细胞体积大，便于操作。 c. 卵母细胞内卵黄多，营养物质丰富。 ④ 代孕母体没有为克隆动物提供遗传物质，因此，克隆动物的性状与代孕母体没有直接关系。 ⑤ 核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同 a. 克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但其核外线粒体中的DNA来自受体卵母细胞。 b. 性状是基因与环境共同作用的结果。供核动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其性状也不可能和供核动物完全相同。 c. 在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。
• 胚胎工程
  • 概念
    • 对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求
  • 理论基础
    • 受精
      • 概念
        • 精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程
      • 场所
        • 输卵管
      • 过程
        • 准备阶段
          • 精子获能
            • 刚刚排出的精子，不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力。
          • 卵子的准备
            • 卵子要在输卵管内进一步成熟，到减数第二次分裂中期时，才具备与精子受精的能力。
        • 受精阶段
          • 精子穿越卵细胞膜外的结构
            • 顶体反应使体内的酶释放出来并溶解放射冠内的卵丘细胞之间的物质，透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障
          • 精子接触卵细胞膜
            • 卵细胞膜反应是防止多精人卵受精的第二道屏障
          • 原核的形成
            • ①精子人卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂，随后形成新的核膜，最后形成雄原核 ②被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核
          • 雌雄原核的融合
            • 雌雄原核融合形成合子（受精卵形成）
      • 注意事项
        • 两道屏障防止多精入卵，保证受精卵中遗传物质与亲代体细胞一致，从而保证遗传的稳定性 受精的标志是第二极体的形成，受精完成的标志是雌、雄原核融合成合子
    • 胚胎的早期发育
      • 场所
        • 输卵管
      • 过程
        • 胚胎发育的起点是受精卵，受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，此时胚胎开始发育，即胚胎发育的最初场所是输卵管，以后逐步向子宫移动，最后在子宫内着床，直至发育成为成熟的胎儿。 早期胚胎发育的营养物质来自卵黄，后期通过胎盘从母体吸收营养物质。
        • 胚胎早期发育各时期
          • 受精卵
          • 卵裂期
            • ①细胞分裂方式：有丝分裂　　　　 ②细胞数量不断增加，胚胎总体积并不增加
          • 桑葚胚
            • 卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团形似桑葚，细胞均未分化，细胞具有全能性，是胚胎分割的最佳时期。
          • 囊胚
            • 细胞逐渐分化 胚胎一端的细胞(内细胞团)分化为胎儿的各种组织，透明带内壁扩展和排列的细胞(滋养层细胞)分化为胎膜和胎盘，胚胎内部出现了含有液体的囊胚腔，开始出现细胞分化，但内细胞团细胞仍具有全能性，可用于胚胎分割。 孵化：囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来
          • 原肠胚
            • 形成外胚层、内胚层和中胚层进一步分化出各种组织、器官
  • 技术及应用
    • 体外受精
      • 过程
        • 卵母细胞的采集与培养
          • 卵母细胞的采集和培养方法 (1)超数排卵技术：促性腺激素可作用于卵巢，促进雌激素的分泌，进而促进卵子的排出，从输卵管中冲取的卵子，已发育至减数第二次分裂中期的，可直接与获能的精子进行受精作用。 (2)从卵巢中采卵：卵巢中的卵母细胞为初级卵母细胞，需在体外培养至减数第二次分裂中期，才能进行体外受精。
        • 精子的采集与获能
          • 精子获能的方法： 培养法 化学诱导法：即将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能
        • 体外受精
          • 原理
            • 人工模拟体内环境(包括营养、温度、pH等)，使卵母细胞成熟、精子获能，最终完成受精和胚胎保存
        • 受精卵培养
          • 当胚胎发育到适宜的阶段，可将其取出向受体移植，或冷冻保存
      • 注意事项
        • 精子获能处理前进行离心处理，目的是除去精清以利于精子获能 试管动物和克隆动物的区别： ①生殖方式不同：试管动物属于有性生殖，克隆动物属于无性生殖。 ②培育的技术手段不同：试管动物需采用体外受精、胚胎移植等技术，克隆动物需采用核移植、胚胎转移技术。 ③是否遵循遗传定律：试管动物遵循遗传定律，克隆动物不遵循遗传定律。
    • 胚胎移植
      • 概念
        • 将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术
      • 实质
        • 早期胚胎在相同生理环境条件下的空间位置转移，而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此能保持其原来的遗传特性
      • 胚胎来源
        • (1) 雌性动物体内的早期胚胎。 (2)通过体外受精和早期胚胎培养得到。 (3)通过哺乳动物体细胞核移植及培养得到。
      • 基本程序
        • 对供、受体的选择和处理
          • 选择：遗传性能和生产性能优秀的个体（供体），健康、有正常繁殖能力的个体（受体） 处理：同期发情处理、超数排卵处理
        • 配种或人工授精
        • 胚胎的收集、检查、培养或保存
          • 收集：冲卵 检查：发育到桑葚胚或囊胚阶段 保存：-196℃的液氮中保存
        • 胚胎移植
          • 胚胎移植的条件 (1)胚胎移植一般应在同种的雌性供体和受体之间进行。这里的“同种”是指“同物种”。 (2)进行胚胎移植的供、受体生理状态要相同。 ①应对供体和受体母畜进行同期发情处理，使它们的生理条件达到同步或一致，这样才能使供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件，这是胚胎移植成功与否的关键。 ②移入受体子宫胚胎的位置应该与其在供体子宫内的位置相同或相似。
        • 胚胎移植后的检查
          • 检查受体母牛是否妊娠
      • 意义
        • (1)充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。 (2)大大缩短了供体本身的繁殖周期。 (3)对供体施行超数排卵处理后，增加后代数量。
      • 注意事项
        • 超数排卵处理中使用的是促性腺激素而不是性激素： 性激素是由性腺产生并释放的，长期使用外源性激素会导致性腺萎缩。促性腺激素由垂体产生并释放，作用于性腺，可以促进排卵，并且不会使性腺萎缩。
    • 胚胎分割
      • 概念
        • 采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术
      • 基础
        • 理论基础
          • 细胞的全能性
        • 物质基础
          • 每个细胞核内具有相同的遗传物质
      • 特点
        • 每个后代具有相同的遗传特性
      • 仪器设备
        • 体视显微镜和显微操作仪
      • 工具
        • 分割针或分割刀
      • 操作对象
        • 发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚
      • 过程
      • 注意事项
        • ①在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割，若分割不均，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题 ②分割的份数越多，每一份的细胞数会越少，不但难以做到均等分割，而且作为囊胚期的胚胎内细胞团的细胞所受的影响会越大。因此，分割的份数越多，技术难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会越低 ③选择桑葚胚或囊胚时期的胚胎进行分割的原因是：桑葚胚或囊胚阶段的胚胎。桑葚胚阶段尚未出现细胞分化，具有全能性；囊胚阶段的内细胞团具有全能性。 ④鉴定胚胎的性别做DNA分析时取样的滋养层而不是内细胞团细胞是因为：取滋养层细胞做DNA分析鉴定性别，不会影响胎儿的发育
      • 意义
        • (1)促进优良动物品种的繁殖，产生遗传性状相同的后代用于遗传学研究。 (2)对胚胎进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代有重要意义。
• 基因工程
  • 概念
  • 基本工具
    • 限制性内切核酸酶（又称限制酶）
      • 能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端
    • DNA连接酶
      • E.coli DNA连接酶
        • 只能连接黏性末端
      • T4 DNA连接酶
        • 既能连接黏性末端，又能连接平末端
    • 载体
      • 种类
        • 质粒、噬菌体、动植物病毒等
      • 结构
        • 其上有复制原点、启动子、终止子、标记基因、限制酶的酶切位点等结构
      • 质粒作为载体的特点
        • a. 能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制（能在细胞中进行自我复制，或将目的基因整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制。），以便提供大量的目的基因 b. 具有一个或多个限制酶切点，以使目的基因能够与其结合 c. 具有某些标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择 d. 对宿主细胞无伤害，以便于目的基因的表达 e.有启动子和终止子
  • 基本操作程序
    • ①目的基因的筛选与获取
      • 筛选
        • 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
      • 获取
        • 利用PCR方法获得扩增从基因文库（包括基因组文库和cDNA文库）中获取或人工合成的目的基因
    • ②基因表达载体的构建
      • a.必须用同种限制酶或产生相同末端的限制酶分别切割质粒和外源DNA，使之产生相同的末端 b.通常用两种限制酶分别切割质粒和外源DNA，避免质粒的自我环化和外源DNA反向插入质粒
    • ③将目的基因导入受体细胞
      • 植物
        • 花粉管通道法
        • 农杆菌转化法（农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；农杆菌的Ti质粒上的T­DNA能够整合到所侵染细胞的染色体DNA上。）
      • 动物
        • 显微注射法（常用受体细胞：受精卵）
      • 微生物
        • 用Ca2+ 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(感受态)，然后将重组表达载体导入其中（常用受体细胞：大肠杆菌）
    • ④目的基因的检测和鉴定
      • 分子水平
        • a) 通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因(DNA分子杂交)或检测目的基因是否转录出mRNA (分子杂交) 。 b) 从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
      • 个体水平
        • 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等
  • PCR聚合酶链式反应
    • 原理
      • DNA的半保留复制
    • 仪器
      • PCR仪
    • 反应体系
      • 模板，两种引物，PCR MIX（Taq酶，缓冲液，Mg2+，4种NTP）
    • 反应过程
      • 变性
        • 温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链
      • 复性
        • 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
      • 延伸
        • 温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶(Taq 酶)的作用下加到引物的3′端合成子链
      • 重复循环多次
  • 应用
    • 基因工程在农牧业方面的应用
      • 转基因抗虫植物、转基因抗病植物、转基因抗除草剂植物、改良植物的品质、必需氨基酸含量多的蛋白质、改善畜产品的品质
    • 基因工程在医药卫生领域的应用
      • 乳腺生物反应器
        • 在目的基因的上游链接一个特异性在乳腺细胞中表达的启动子
• 蛋白质工程
  • 流程
    • 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
  • 优点
    • 可以生产自然界中不存在的蛋白质
• 生物技术的安全性和伦理问题
  • 禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆 中国在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散