细胞工程 动物细胞工程 细胞融合与单克隆抗体

教材：细胞工程第二版 安利国 内容：第二篇动物细胞工程-第5章细胞融合与单克隆抗体 重点已标注，希望能帮助到大家。 制作不易，请多支持。

细胞融合与单克隆抗体

• 细胞融合
  • 概念
    • 体细胞杂交或细胞杂交
    • 在外力（诱导剂或促融合剂）作用下
    • 两个或两个以上的细胞或原生质体相互接触
    • 发生膜融合、胞质融合和核融合并形成同种多倍体或杂种细胞
  • 过程
    • 两个亲本细胞并列
    • 膜组织局部破坏
    • 形成包围融合细胞的连续胞膜
    • 融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。
  • 细胞融合的基本技术
    • 促细胞融合的方法
      • 病毒融合剂诱发细胞融合
        • 仙台病毒(HVJ)是最早用于动物细胞融合的融合剂
        • 原理
          • 病毒被膜含有膜蛋白，其表面有许多具神经氨酸酶和凝血活性的刺起
          • 降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围
          • 在高pH和Ca2+的条件下，膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中脂类分子重排，从而打开质膜，导致细胞融合
      • 化学融合剂诱发细胞融合
        • 聚乙二醇(PEG)
        • 原理
          • 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失
          • 由于高度脱水引起细胞凝集，形成大小程度不同的凝集物
          • 细胞发生皱缩并大大扭曲变形，邻近细胞之间紧密接触
          • 在相邻细胞膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的脂质与脂质反应。
          • 继之，脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后细胞质桥逐渐扩大，两个细胞最终融合。
      • 电融合法
        • 直流电脉冲诱导细胞间融合
        • 原理
          • 当细胞处于强电场脉冲时，电脉冲诱发细胞膜结构紊乱，膜上会短暂地形成微膜孔，相邻两个细胞紧密排列部位的微孔就会有物质交流，形成细胞膜桥和细胞质桥，进而引起细胞融合产生杂交细胞。
        • 扩展
          • 离心电融合
          • 特异性电融合
          • 细胞化学聚集电融合
          • 磁－电融合
  • 融合细胞的筛选
    • 概念
      • 异核体 或异核细胞
        • 含两个不同亲本细胞核的细胞
      • 同核体或同核细胞
        • 由同一亲本细胞融合形成的细胞
    • 选择系统
      • 标志
        • 酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为
      • 最常用
        • 酶缺陷型HAT选择培养法。
    • HAT选择系统（酶缺陷型）
      • 次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)
      • 原理
        • 细胞内核苷酸的生物合成
          • 主要途径
            • 氨基喋呤(A)可阻断
          • 补救途径
            • 两种酶参与
              • HGPRT酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)
                • 次黄嘌呤(H)催化产生肌苷酸
              • TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶)
                • 胸腺嘧啶核苷(T)催化产生脱氧胸苷
              • 合成DNA
        • HGPRT－或TK－酶缺陷型细胞只有与能提供HGPRT或TK酶的正常细胞相融合，产生的杂交细胞才能在含HAT培养液中存活下来
    • 基于营养缺陷型细胞所建立的筛选
      • 不同营养缺陷型的细胞生成杂交细胞
      • 融合后
        • 基因互补得以在缺乏相应营养物的培养基中得以生存
      • 未融合
        • 细胞由于代谢受阻而死亡
  • 融合的细胞可以用有限稀释克隆法、琼脂培养基克隆法、毛细胞克隆法、荧光激活分选法等方法进行克隆化培养。
  • 应用
    • 单克隆抗体制备
    • 基因定位
    • 遗传基因的缺陷互补
    • 分化功能的表达调控
    • 细胞核移植
• 单克隆抗体技术
  • 概念
    • 多克隆抗体
      • 由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体
    • 单克隆抗体
      • 每一个 B 细胞只分泌产生一种抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。 大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体
    • 单克隆抗体技术
      • 细胞融合技术
      • 将产生特定抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合
      • 得到既可分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞
      • 从而产生针对某一抗原的单克隆抗体
  • 杂交瘤细胞株
    • 既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力
    • 又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点
    • 不断在细胞培养上清液中产生单抗。
  • 单克隆抗体技术
    • 免疫动物
      • 动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同一品系动物，多为BALB/c小鼠
      • 抗原
        • 可溶性抗原（蛋白质、核酸、多糖、多肽等）
          • 需加佐剂
            • 初次免疫时一般用完全弗氏佐剂
            • 以后加强免疫时一般用不完全弗氏佐剂制成乳剂进行免疫。
        • 颗粒性抗原（细胞、病毒、细菌等）
          • 较强的抗原性，免疫时可不加佐剂
      • 腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、脾内免疫等
    • 脾细胞的分离
      • 对抗原特异性的B细胞进行富集
    • 骨髓癌细胞的准备
    • 细胞融合
      • 一般用PEG诱导
      • 在10 min 内完成
      • 骨髓瘤细胞：脾细胞为1～2：10
    • 融合细胞的筛选与克隆
      • 初步筛选
        • 以 HAT 培养
      • 抗体专一性筛选
        • 第二抗体法
          • 固相放射免疫测定法(RIA)
          • 酶联免疫法 (ELISA)
          • 荧光活化细胞分类器法(FACS)
        • 抗原结合法
        • 功能筛选法
      • 细胞克隆化
        • 有限稀释法
        • 软琼脂法
        • 再次以 ELISA 筛选专一性抗体
    • 单克隆抗体的大量制备
      • 体内法
        • 把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水
        • 抗体浓度高
        • 不适合大规模生产，腹水中有可能混有小鼠本身的抗体，给纯化抗体带来困难
      • 体外法
        • 在大型培养瓶中用无血清培养基进行培养，收集培养液上清即得抗体
        • 抗体浓度低
  • 单克隆抗体的特性
    • 具有明确的特异性
    • 高亲和力
    • 也可能显示潜在的交叉反应
  • 人源性单克隆抗体和基因工程抗体
    • 由于大多数单克隆抗体是鼠源性的，在人类疾病的治疗中会产生人抗鼠反应。对抗体进行改造获得人源性抗体或基因工程抗体以减少人抗鼠反应。
    • 人源性单克隆抗体
      • EB病毒转化技术
        • 利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞
        • 使之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系，这些细胞可在体外分泌人抗体
      • 人－鼠杂交瘤单克隆抗体
      • 人－人杂交瘤单克隆抗体
      • 构建转人Ig基因组小鼠
        • 将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠
      • 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体
    • 基因工程抗体
      • 人－鼠嵌合抗体
      • 改型抗体
        • CDR移植
      • 抗体片段
        • Fab抗体
        • 单链抗体(ScFv)
      • 噬菌体抗体文库技术
      • 表位印迹选择技术
  • 单克隆抗体的应用
    • 理论研究
      • 构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性
      • 进行表位分析
    • 诊断试剂中的应用
      • 用针对肿瘤细胞表面特异抗原的单克隆抗体在帮助诊断癌症
        • 癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体在帮助诊断结肠癌和直肠癌
        • 前列腺酸性磷酸酶的单克隆抗体在帮助诊断前列腺癌
      • 同位素标记的单克隆抗体用于肿瘤显像定位
        • 诊断肿瘤患者是否有转移病灶
    • 疾病治疗上的应用
      • 肿瘤、细菌、病毒、寄生虫和霉菌性疾病，自身免疫病、移植排斥以及解毒等
        • 在移植排斥和自身免疫病、细菌感染等方面已有成功的报道
      • 针对性杀死肿瘤细胞达到治疗疾病
        • 单克隆抗体有可能作为体内应用的单克隆靶向制剂的载体，与同位素、药物、毒素、细胞因子等可杀死肿瘤细胞的物质交联，使这些物质能够准确到达肿瘤细胞所在的部位