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生化重点章节知识框架
本知识框架为自用，整理内容均为作者本人所认为的重点知识，实验技术请自行补充。
编辑于2020-11-03 09:17:10- 相似推荐
- 大纲
生物化学
蛋白质
氨基酸
氨基酸的分类
根据侧链基团极性分类
非极性
丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸
极性不带电
丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸
极性带负电
谷氨酸、天冬氨酸
极性带正电
组氨酸、赖氨酸、精氨酸
根据自身是否合成分为
必需氨基酸
缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸
非必需氨基酸
其他
根据化学结构
脂肪族
丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸
芳香族
苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸
杂环族
脯氨酸、组氨酸
等电点及测定
使氨基酸或蛋白质净电荷为零的环境pH称为该氨基酸或蛋白质的等电点，在此状态下溶解度最小
pH与pI
pH>pI
氨基酸带负电
pH=pI
氨基酸净电荷为零
pH<pI
氨基酸带正电
pI的计算公式
中性氨基酸
侧链不游离或非极性
pI=1/2(pK1+pK2)
碱性氨基酸
pKR>7
pI=1/2(pK2+pKR)
酸性氨基酸
pKR<7
pI=1/2(pK1+pKR)
画图辅助判断
蛋白质结构
一级结构
蛋白质分子中氨基酸的排列顺序
功能：一级结构决定高级结构；携带生物进化的信息
二级结构
蛋白质多肽链主链的折叠方式，借助氢键形成的有规律的局部结构
分类
α螺旋
右手螺旋，每3.6个氨基酸上升一圈，所有肽键都参与形成链内氢键，任一-C=O与其后第四个肽键上的-NH之间形成氢键
β折叠
β股之间通过主链之间的氢键相联系，呈锯齿状展开，至少由两个β股组成；R基团在主链上上下交替排列；两股成反平行或平行，反平行更稳定
β转角
由四个氨基酸组成，n与n+3位的氨基酸形成氢键，富含脯氨酸和甘氨酸的四个氨基酸更容易形成β转角
β突起
可视为在一个正常的β折叠的β股中引入一个额外的氨基酸残基后，对原来结构的一种破坏
无规卷曲
不能被明确归入折叠或螺旋的多肽区段
往往构成酶活性部位或其他蛋白质特异的功能部位
α-角蛋白
主要由α-螺旋结构组成
β-角蛋白
主要由-β折叠结构为主
氢键
超二级结构
模体
二级结构的组合方式
αα
两或三股右手α螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋
βαβ
由三段平行式的β折叠和两段α螺旋构成
βββ
β曲折、回形拓扑结构（希腊钥匙）
结构域
是一个蛋白质分子上相对独立、稳定的球状结构单位
氢键、疏水作用
三级结构
整个多肽链在二级、超二级结构的基础上盘旋折叠，形成的特定空间结构
种类
全α结构蛋白、α-β结构蛋白、全β结构蛋白
特点
许多在一级结构上相差很远的氨基酸在三级结构上相距很近
三级结构很密实，大部分水分子被从核心排出，使极性、非极性基团间的相互作用成为可能
氢键、疏水作用
四级结构
寡聚蛋白中各亚基的空间排布
不是所有蛋白质都有四级结构
必须两个以上肽链且无硫键
主要是疏水作用，其次是氢键、盐键
结构与功能的关系
蛋白质的功能是由其三维结构决定的
相似的一级结构具有相似功能
一级结构变化影响蛋白构象与功能
结构与功能关系十分密切，结构是功能的基础，结构改变往往导致功能改变
肽键的重要特征
肽键能耐受水解，动力学上稳定
肽键是平面结构，因为C-N具有双键特性
各肽键既能提供氢键供体（NH）又能提供氢键受体（C=O），肽键骨架基团间形成氢键是独特性质
肽键不带电荷，因此多肽链能紧密压缩成球状并将大量骨架包埋于内部
测序
氨基酸的化学反应
α-氨基的反应
与亚硝酸反应
生成氮气，可计算出氨基酸的量，用于定量以及测定蛋白质水解程度
与酰化试剂反应
在弱碱中与酰氯或酸酐发生作用，氨基被酰基化
苄氧酰氯等酰化剂在人工合成蛋白中被用作氨基保护剂
丹磺酰氯（DNS）可用于多肽链N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定
羟基化反应
sanger反应
2,4,-二硝基氟苯（DNFB或FDNB）生成DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，用于测定多肽N末端氨基酸
edman反应
苯异硫氰酸酯（PITC）→甲氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸）→PTH-氨基酸，无色，可用层析法分离鉴定，鉴定多肽N末端氨基酸
生成西佛碱的反应（schiff）
与醛类发生反应，生成西佛碱，是某些酶促反应的中间产物
α-羧基的反应
成盐、成酯
分别与碱、醇反应
成酰氯的反应
氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯，此反应使羧基被活化，易与另一个氨基酸的氨基结合，在人工合成中常用
氨基羧基共同参与的反应
茚三酮反应
与氨基羧基反应，生成紫色物质，可用于氨基酸的定性和定量
侧链R基团参与的反应
色氨酸的乙醛酸反应（ehrlish反应）
酪氨酸的米伦氏反应（millon反应）
苯丙氨酸黄色反应
组氨酸、酪氨酸的波利反应（pauly反应）
蛋白质测序的策略
测定蛋白质分子中多肽链的数目
拆分蛋白质分子的多肽链
断开多肽链内的二硫桥
分析每一多肽链的氨基酸组成
鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
裂解多肽链成较小的片段
测定各肽段的氨基酸序列
重建完整多肽链的一级结构
确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置
从蛋白质序列中了解很多信息
与已知序列比较，确定是否属于某个蛋白质家族，从而推测该蛋白质的结构和功能
与不同物种的同一蛋白进行比对，找出进化关系，推测出物种间系谱关系
搜寻蛋白质内部有无重复序列，重复序列能揭示本身进化史
含有定位序列或控制活性的序列
序列数据提供了制备该蛋白特异性抗体的基础
序列在制造该蛋白质编码基因特异性DNA探针方面非常有用
结构与功能的关系
血红蛋白和肌红蛋白的结构与功能的比较
相同：有相似的三级结构，有相似的氧结合机理
不同：肌红蛋白是单体蛋白，氧结合曲线是双曲线特征，低氧时高亲和力，有利于从含氧少的血液中吸取氧；血红蛋白是寡聚蛋白，氧结合曲线是S形特征，低氧时低亲和力，高氧时高亲和力
血红蛋白协同效应有利于其在高氧部位结合氧，低氧部位释放氧
血红蛋白的别构效应
别构效应：一个配基与蛋白质结合影响该蛋白质其余结合位点与其配基的亲和性
降低血红蛋白与氧结合的别构效应剂：H+、CO2、BPG
镰刀型贫血症
正常血红蛋白HbA和异常血红蛋白HbS的氨基酸序列不同，HbA的β链6位的谷氨酸突变为HbS的缬氨酸，从而使HbS自发聚合产生纤维状沉淀，红细胞变形
抗体的四级结构和功能
抗体识别抗原的位置为CDR，高度可变
分离纯化鉴定
方法
根据相对分子质量
沉降速度法离心
根据相对分子质量和分子形状
凝胶过滤（分子排阻层析）
根据电荷选择性溶解或沉淀
等电点沉淀
根据电荷和相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳
根据密度
沉降平衡法离心
根据溶解度选择性溶解或沉淀
硫酸铵分级沉淀
有机溶剂分级沉淀
根据对其配基的亲和性
亲和层析
纯度鉴定
通常采用分辨率高的物理化学方法
PAGE、等电聚焦、毛细管电泳、沉降分析和HPLC
蛋白质生物合成
遗传密码的特点
连续性
简并性
同一种氨基酸有两个或更多密码子的现象，二十种氨基酸中，色氨酸和甲硫氨酸只有一个密码子，其他的不止一个
生物学意义：一旦DNA分子上发生碱基突变，突变后形成的三联体密码子，可能与原来的密码翻译成同样的氨基酸，或化学性质相近的氨基酸，这样多肽链就不会表现出变异或变化不明显——简并性对生物遗传的稳定性有重要的意义
摆动性（变偶性）
tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时，密码子第一二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定的变动。tRNA反密码子中除了AUGC外，还有第一位出现的次黄嘌呤（I）。I可以以UAC之间配对，识别更多密码子
tRNA反密码子的第一位在三个碱基的最右边
摆动性配对
反密码子第一位是C或A时，只能识别密码子第三位的一种（即C对G，A对U）
反密码子第一位是U或G时，可识别密码子第三位的两种（U对A/G，G对C/U，即UG配对)
反密码子第一位是I时，可识别三种（I对A/U/C）
意义
防止第三个密码子不同的同一氨基酸的蛋白质合成发生错误，即维持生物表型的稳定；也合理地解释了简并性，将DNA突变的危害降低
通用性和变异性
遗传密码的防错系统
生物合成体系
合成原料：氨基酸；模板：mRNA；运载体：tRNA；装配场所：核糖体
蛋白质因子（原核）
起始因子：参与启动
IF1：促使携带氨基酸的启动tRNA与小亚基结合
IF2：功能同上，且有GTP酶活性
IF3：促进小亚基和mRNA特异结合；在终止阶段后促使脱落的核糖体蛋白解离为大小亚基
延长因子：协助肽链的延长
EFTu和EFTs延长因子作用于肽链延长阶段；促进氨基酰-tRNA进入核糖体的受位；具有GTP酶活性
EFG作用于肽链延长阶段；具有GTP酶活性，使转肽后失去肽链的tRNA从给位上脱落，并促进移动
终止因子：识别终止信号
RF使大亚基转肽酶将给位上已合成的肽链水解释放
RF1或RF2结合到受位（A位）附近；RF1用于UAA或UAG；RF2用于UAA或UGA
RF3结合在其他位置
生物合成过程
起始过程
除起始因子辅助外，还需要GTP，真核还需要ATP
肽链延长阶段
每增加一个氨基酸，就按进位、转肽、脱落、移位这四个步骤重复进行
转肽需要转肽酶的催化，需要Mg2+和K+
终止阶段
需要终止因子参与，真核终止因子为RF，原核为RF1、RF2、RF3
合成过程中不同阶段的能量来源
氨基酸的活化和活化氨基酸的搬运
ATP供能
肽链延长阶段：进位、移位
GTP供能
翻译准确性的保证
氨基酸与tRNA的特异性结合
密码子和反密码子的特异性结合
肽链合成后的共价修饰方式
糖基化
影响肽链的折叠，以及蛋白质的分泌和定位
磷酸化
对信号转导的调控，对活性的影响
甲基化
影响蛋白质和其他分子的相互作用
乙酰化
防止肽链降解
羟化
某些蛋白质中的脯氨酸和赖氨酸经羟化后，可以进一步糖基化
酰化
有利于和质膜的结合
真原核蛋白质合成过程的比较
真：翻译与转录不偶联，mRNA需加工修饰；原：翻译与转录偶联，mRNA无“帽”无“尾”
真：mRNA半寿期约4~6小时，较稳定，易分离；原：mRNA半寿期约1~3分钟，不稳定，不易分离
真：mRNA为单顺反子；原：mRNA为多顺反子
真：起始阶段需要GTP、ATP；原：起始阶段需要GTP
真：延长阶段GTP水解后可被ATP再磷酸化，两种延长因子可同时结合核糖体；原：GTP水解后EFTu即从核糖体上脱落
真：只有一种终止因子；原：有三种终止因子
真：合成速度慢；原：合成速度快
真：可被环己亚胺、白喉毒素等抑制；原：可被氯霉素、链霉素、四环素等抑制
蛋白质的糖基化
蛋白质的糖基化使多肽链变成糖蛋白；糖基一般连接在四种氨基酸上，分为两种
O-连接的糖基化
与ser、thr和hyp（羟脯氨酸）的OH连接，连接的糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，在高尔基体上进行O-连接的糖基化
N-连接的糖基化
与天冬酰胺残基的NH2连接，糖为N-乙酰葡糖胺，在内质网上进行，糖的供体为核苷糖，如CMP-唾液酸、GDP-甘露糖、UDP-N-乙酰葡糖胺
对膜蛋白功能的作用
保护、稳定作用
作为外源受体的特异性配体
作为特异性受体
内源性受体的配体，参与介导清除、周转及胞内穿行作用
受精过程中起重要作用
核糖体
受位（A位点）
氨酰tRNA结合位点
给位（P位点）
肽酰tRNA结合位点
信号肽
蛋白质组
蛋白质组学针对的是全体蛋白质，以2D-Gel和质谱为主，分为top-down和bottom-up两种分析方法。用化学方法分解成小肽段，再反推蛋白质序列，搜索标识未知序列
应用：寻找某些疾病特异性的蛋白分子，可成为新靶点或诊断标志
酶学
酶催化的特点
与一般催化剂的共性
催化效率高、用量少
不改变化学平衡点
降低反应活化能
反应前后自身结构不变
自身特点
易失活：反应条件温和
高度专一性，几乎没有副反应
酶活性可受到调节和控制
酶的分类
氧化还原酶
转移酶
水解酶
裂解酶
异构酶
合成酶
酶活力的测定
酶活力
指酶催化某一化学反应的能力
酶活力单位（U）
1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）
比活力
每毫克酶蛋白所具有的酶活力
酶活力测定方法
主要是测定产物增加量或底物减少量
分光光度法、荧光法、同位素测定法、电化学法
反应动力学
米氏方程
V=Vmax[S]/（Km+[S]）
Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数（为反应速度最大速度一半时的[S]）
Km值大小反映酶与作用物亲和力大小
Km小，亲和力大，Km大，亲和力小
Kcat：转换数，表示酶的催化效率，指单位时间内每个活性中心转换底物的分子数，或一定条件下每秒每个酶分子转换底物的分子数
Vmax和Km的求法：双倒数作图法
将米氏方程作倒数处理
以1/V对1/[S]做图，可得一条直线，纵截距为1/Vmax，横截距为-1/Km
多底物酶促反应机理
有序顺序反应机理
底物A、B与酶结合的顺序是一定的，产物P、Q的释放顺序也是一定的
随机顺序反应机理
底物A、B与酶结合的顺序是随机的，产物P、Q的释放顺序也是随机的
乒乓反应机理
先结合第一个底物A，释放第一个产物P，酶构象发生变化，结合第二个底物B，释放第二个产物Q
pH的影响
影响构象，使酶变性；影响酶和底物活性中心的解离状态；影响其他基团的解离，使专一性和酶活性中心受到影响
最适pH不是酶的特征常数
酶的抑制剂
不可逆抑制剂
与酶共价连接，使酶失活；无法用透析、超滤等物理方法消除抑制
Ks型和Kcat型
可逆抑制剂
竞争性抑制剂
底物与竞争性抑制剂结合在酶活性中心同一位置，即与底物竞争酶活性中心
增加底物浓度可减少竞争性抑制剂的作用
Km变大，Vmax不变
非竞争性抑制剂
底物与抑制剂不在同一位点结合
增加底物浓度不影响抑制作用
Km不变，Vmax减小
反竞争性抑制剂
抑制剂只与酶和底物的复合物结合
增加底物浓度反而增加抑制程度
Km变小，Vmax变小
酶的作用机理
专一性机理
活性部位
指酶分子中直接与底物结合并催化底物反应的部位，通常只处于或靠近酶分子的表面，只占酶分子的很小部分
具有柔性和可运动性
专一性假说：诱导契合学说
当作用物分子与酶分子相碰时，可诱导酶的构象变得能与作用物配合，然后才结合成中间复合物，进而引起作用物分子发生相应的化学变化
高效性机理
邻近效应与定位效应
富集底物，使其固定在活性中心附近；使反应基团的分子轨道正确交叠，易于发生反应
扭曲变形和构象变化
使底物敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力
酸碱催化
瞬时提供、接受质子，稳定过渡态
共价催化
酶亲核基团释放电子，攻击底物缺电子中心，迅速形成中间复合物，使反应加速
活性中心微环境
疏水，有电荷离子，可稳定过渡态，增加酶促反应速度
酶活性的调节控制
别构调控
指效应物与别构酶分子中的别构中心结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对第五的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度
特点
多为寡聚蛋白，有一个或多个别构部位
常位于代谢途径的开始或分支点
不遵循米氏动力学，正协同类似S形，负协同类似双曲线
别构模型
齐变模型（WMC）
两种状态，利于结合的松弛型构象R型，不利于结合的紧张型构象T型
各亚基同时处于同一状态，受外界条件和亚基间相互作用影响
很好的解释了正协同效应
序变模型（KNF）
配体不存在时，T型，结合配体后诱导向R型转变
以序变的方式进行，配体结合一个亚基后，使邻近亚基易于变化，存在有TR型杂合态
适合解释正、负协同效应
酶原激活
具有不可逆性
本质是切断酶原分子中特异肽键或去除部分肽段，即酶原在一定条件下被打断一个或几个特殊的肽键，从而使构象发生定向变化，形成具有活性的三维结构的过程
实质是酶活性中心的形成或暴露
意义
保证合成酶的细胞本身不受蛋白酶的消化破坏
使它们在特定的生理条件和部位受到激活并发挥其生理作用
可逆共价修饰
被其他酶催化进行共价修饰，在活性形式和非活性形式之间相互转变，如糖原磷酸化酶
其他酶
核酶
具有催化功能的RNA
抗体酶
又称催化性抗体，是一种具有催化功能的抗体分子
同工酶
是指催化相同的化学反应，但其分子结构、理化性质等方面存在明显差异的一组酶
生物学功能
作为遗传标志，是分子水平的指标
和个体发育及组织分化密切相关，会分化、转变
适应不同组织或细胞器在代谢上的不同需要
催化同一反应，但不一定具有相同的功能，且活性也不同
酶工程
酶在工程领域的应用，包括酶的大规模生产、酶的固定化、酶的化学修饰和化学合成
用基因工程的方法生产和改造酶
核酸
DNA的结构与功能
一级结构
是四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体
核苷酸的排列顺序代表了遗传信息
二级结构
DNA是含两条多核苷酸的双螺旋分子
碱基互补配对
A=T,C=G,A+G=C+T
DNA分子双螺旋结构模型
定义
两条多核苷酸链反向平行，彼此按A=T，G=C碱基配对形成氢键
两条链彼此缠绕，形成右手螺旋（B型，直径2nm，碱基对距离0.34nm，螺距3.4nm，10对核苷酸一螺圈
磷酸核糖骨架在外，碱基对平面垂直于核糖平面，层叠堆积在内
螺旋体表面形成两条凹槽，一个大槽（沟），一个小槽（沟）
其他形式的DNA双螺旋
A型——右手双螺旋的碱基对平面与螺轴不垂直（倾斜20°），碱基对距离0.28nm，螺距3.2nm，11对核苷酸一圈（A型双螺旋短而宽）
Z型——左手双螺旋，重复单位为嘌呤-嘧啶，高盐环境下稳定，碱基对距离0.38nm，螺距3.5nm，12对核苷酸一圈（Z型双螺旋细而长）
稳定双螺旋结构的因素
碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）
碱基配对的氢键，GC越多，越稳定
磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白中的阳离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的斥力
碱基位于内部疏水环境，可免受水溶性活性小分子攻击
三级结构
主要形式为超螺旋，生物体内最常见的是负超螺旋，为左手超螺旋
与蛋白质的复合结构
真核生物中，超螺旋盘绕在组蛋白聚合体表面，形成核小体结构，这是染色质的基本结构单位
功能
其基本功能是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，是生命遗传繁殖的物质基础和个体生命活动的基础
RNA的结构与功能
RNA的结构一般以单链形式存在，在局部可形成双螺旋结构，成茎环样或发夹结构
种类及功能
核糖体RNA（rRNA）
核糖体的组成成分
信使RNA（mRNA）
蛋白质合成模板
转运RNA（tRNA）
转运氨基酸
不均一核RNA（hnRNA）
成熟RNA的前体
小核RNA（snRNA）
参与hnRNA的剪接、转运
小胞浆RNA（scRNA）
蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分
小核仁RNA（SnoRNA）
参与rRNA的加工和修饰
结构
天然RNA分子都是单链线形分子，是有部分区域是A-型双螺旋结构
mRNA的结构
真核生物mRNA都是单顺反子，有5'端帽子和3'端Poly（A）尾
原核mRNA是多顺反子，没有帽和尾，两端各有一段非翻译区（UTR）
tRNA的结构
通常由73~93个核苷酸组成，含较多的稀有密码子
二级结构为三叶草型
三环一柄
二氢尿嘧啶环
反密码子环
VΨC环
氨基酸臂
三级结构为倒L型
rRNA的结构
原核：5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA
真核：5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA
核酸的性质
水解性质
碱水解
DNA稳定，RNA易被减水解
意义：DNA遗传信息，需要稳定；RNA是信使，完成任务后降解
酶水解
生物体含有多种核酸水解酶，如RNA水解酶、DNA水解酶、核酸外切酶、核酸内切酶，最重要的是限制性核酸内切酶
酸碱性质
核酸等电点在较低的pH范围内，DNA为4~4.5，RNA为2~2.5
核酸的紫外吸收
鉴定纯度
纯DNA的A260/A280为1.8（1.65~1.85），若大于1.8则表示有RNA污染，若过低则说明含有杂蛋白或苯酚
纯RNA的A260/A280为2.0
增色效应与减色效应
增色效应
在DNA变形过程中，摩尔吸光系数增大
减色效应
在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小
单链吸收光能力更强，故双链变单链增色，单链变双链减色
DNA的变性、复性及杂交
变性
氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂
影响DNA的Tm值的因素
DNA均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内
G-C含量高，则Tm越高
离子强度高，则Tm高
复性
变性DNA在适当条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构
影响因素
DNA片段大小
离子强度
温度影响复性速度
核酸的分离提纯与定量测定
DNA的分离
DNA以核蛋白（DNP）形式存在，核蛋白溶于水或盐，但不溶于0.14mol/LNaCl中，利用此性质，可将核蛋白和RNA核蛋百分开，提取出核蛋白。核蛋白可用苯酚法抽提，去除蛋白质，还可以用氯仿异戊醇去除蛋白质，也可用SDS处理
RNA的分离
0.14mol/NaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）；酚提取法小量制备RNA
核酸组分的分离纯化
核酸用化学方法或酶方法降解
可用薄层层析、离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、高效液相层析等方法将其彼此分离
核酸及其组分含量测定
紫外分光光度法，定磷法，定糖法
DNA的复制
DNA的半保留复制
复制时，母链的双链DNA解开成两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链，每个子代DNA双链中，一个是从亲代完整接受来的，一个是完全重新合成的
参与复制的酶和蛋白质因子
DNA聚合酶
以DNA为模板，四种dNTP为底物，催化新链延长，合成起始时需要引物提供3'-OH，生成3,5-磷酸二酯键
还具有核酸外切酶活性
原核：DNA聚合酶I、II、III，其中DNA聚合酶III真正具有合成新链的复制作用
真核：DNA聚合酶α、β、γ、δ，其中DNA聚合酶α、β真正具有合成新链的复制作用
DNA连接酶
连接DNA链3'-OH末端和另一DNA链的5'-P末端，形成3,5-磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链
DNA拓扑异构酶
拓扑异构酶I
不需要ATP，断开双链中的一股，使DNA松弛，再将切合封闭；消除DNA的负超螺旋，改变DNA的超螺旋数
拓扑异构酶II
同时断开DNA双股链，使其松弛、再封闭，利用ATP时，可使松弛DNA变为负超螺旋结构
消除复制叉前进带来的扭曲张力
引物酶
是一种特殊的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，催化一段RNA引物的合成
DNA结合蛋白（SSB）
与DNA分开的单链结合，防止双链重新结合
解链酶
能使碱基对之间的氢键解开，解开一对耗两个ATP
复制的过程
起始
在拓扑异构酶和解链酶的作用下，DNA解为单链
在引物合成酶的作用下合成引物，该酶与6种蛋白结合为引发体
延长
原核生物：DNA聚合酶III
真核生物：DNA聚合酶α催化不连续复制，DNA聚合酶β催化连续复制
一些低等生物或染色体外的DNA采取滚环复制
终止
DNA聚合酶I通过5'→3'外切酶活性切除RNA引物
DNA连接酶封闭切口
DNA聚合酶γ：线粒体内的DNA复制酶，聚合与外切酶活性
DNA聚合酶δ：催化链合成
DNA的半不连续复制
DNA复制时，一条连续，一条不连续
聚合酶合成方向都是5'→3'，而模板链是反向平行的双链，这样在一条链上，DNA合成方向与复制叉移动方向相同，可以连续复制；而在另一条链上，二者方向相反，必须在引物酶的作用下，先合成一段引物，在DNA等聚合酶III的作用下，在引物3'端合成一段1至2kb的冈崎片段，然后由DNA聚合酶I切除引物，相邻片段由连接酶封闭
DNA的损伤修复
错配修复
识别并修正错误的碱基配对的过程
直接修复
损伤的DNA碱基经化学变化恢复为原先的结构
切除修复
在一系列酶的作用下，将DNA分子受损部分切除掉，并以完整的那条链为模板，合成出切除的部分，从而使DNA恢复
复制后修复
重组修复
受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口，完整的另一条母链与有缺口的子链DNA进行重组交换
应急修复和易错修复
受到严重损伤，细胞处于危机状态时所诱导的高错误频率的DNA修复
逆转录
依赖RNA的DNA合成作用，以RNA为模板，合成DNA分子
步骤
以RNA为模板合成DNA
杂化双链上RNA的水解
再以单链DNA为模板合成双链DNA
逆转录酶
依赖RNA的DNA聚合酶
三种酶活性
RNA指导的DNA合成反应
RNA的水解反应
DNA指导的DNA聚合反应
重组
同源重组
发生在同源染色体DNA之间，需要同源染色体的精准配对
特异位点重组
交换序列时只需要短序列同源；取决于蛋白质和DNA的相互作用
转座重组
转座因子从一个染色体迁移到另一个染色体或从一个染色体区域迁移到另一个区域
RNA的合成
RNA聚合酶
原核生物
只有一种
靠σ因子调控
真核生物
三种
RNA聚合酶I，负责转录rRNA
RNA聚合酶II，催化转录mRNA
RNA聚合酶III，催化转录tRNA和其他小分子RNA
启动子和转录因子
原核
两个识别序列，RNA聚合酶识别位点和结合位点
-10序列
结合位点，启动子的关键部位
-35序列
RNA酶的识别区域
真核
三种RNA聚合酶，各有其特点
RNA聚合酶I使用的启动子：由隔开约70bp的两个保守区域构成
RNA聚合酶II使用的启动子：最多样复杂，有三个保守区
TATA框
CAAT框
GC框
RNA聚合酶III使用的启动子：+55bp
转录因子
真核RNA聚合酶II的转录起始复合物的装配需要普遍转录因子（TFII）的协助
TFIIH（BTF2）：多亚基，有DNA解链酶作用
TFIIH激酶：是TGIIH的亚基，可使PolIIc端强磷酸化，获得转录功能
TFIIE通过其亚基与TFIIH的P89相互作用，抑制后者的解链酶作用，增强其ATP酶活性和激酶活性
TBP：是TFIID的亚基，负责识别TATA序列
终止子和终止因子
大肠杆菌中的两类终止子
需要ρ因子的蛋白质的帮助，终止序列具有反向重复，转录产物形成发夹结构
不需ρ因子辅助，除了具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列，回文序列区常有一段富含GC的序列，寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板
抗终止作用
某些噬菌体的时序控制
一般步骤
起始
延伸
终止
RNA的转录后加工
原核生物RNA的加工
rRNA前体的加工过程
rRNA前体→甲基化→切割→16S rRNA、23S rRNA等
tRNA前体的加工
核酸内切酶在tRNA两端切断
核酸外切酶从3'端逐个切去附加序列
tRNA核苷酰转移酶在tRNA3'端加上-CCA-OH
核苷的修饰和异构化
mRNA前体的加工
原核一般不加工
真核生物中RNA的一般加工
剪接
去除内含子
加帽
加尾
化学修饰
碱基甲基化
RNA的拼接、编辑和再编码
拼接
拼接在拼接体哄进行
自我拼接
编辑
再编码
RNA编码和读码方式的改变称为再编码
代谢
代谢总论
电子传递链
电子传递过程
生物氧化过程中形成的还原型辅酶（NADH和FADH2），通过电子传递途径，使其重新氧化，此过程称为电子传递过程
电子传递过程中，还原型辅酶中的氢以负质子（H）形式脱下，其电子经一系列的电子传递体转移，最后转移到分子氧上，质子和离子型氧结合生成H2O
电子传递链
两条电子传递链
NADH氧化呼吸链
复合物I、III、IV
4H+2H+4H
P/O比值为2.5
FADH2氧化呼吸链
复合物II、III、IV
2H+4H
P/O比值为1.5
原核电子传递链在质膜上，真核电子传递链在线粒体内膜上
抑制剂
阻断呼吸链中某一部位的电子传递
鱼藤酮、安密妥、杀粉蝶菌素，阻断电子由NADH向CoQ传递
抗霉素A，抑制电子从细胞色素b向细胞色素c1传递
氰化物、硫化氢、叠氮化物、CO，阻断电子从细胞色素aa3向O2传递
氧化磷酸化
作用机理
化学渗透学说
电子经呼吸链传递释放的能量，将质子从线粒体内膜的内侧泵到内膜的外侧，在膜两侧形成电化学梯度而积蓄能量，当质子顺此梯度经ATP合成酶F0通道回流时，F1催化ADP与Pi结合，形成ATP
解偶联和抑制
解偶联剂
2,4-二硝基苯酚
质子载体
加大内膜对H+的通透性，消除梯度
抑制剂
寡霉素
阻断F0通道
离子载体
调节
ADP和ATP的调节
[ATP]/[ADP][Pi]降低，氧化磷酸化加速
[ATP]/[ADP][Pi]上升，氧化磷酸化减慢
穿梭机制
线粒体外生成的NADH不能直接进入线粒体
甘油-3-磷酸穿梭途径
磷酸二羟丙酮接受NADH的电子，生成甘油-3-磷酸，穿过内膜
甘油-3-磷酸将电子转移到FAD上，生成FADH2以及磷酸二羟丙酮
NDAH电子最终被转移到FADH2上，进入线粒体参与呼吸链，产生1.5ATP
苹果酸-天冬氨酸穿梭途径
只在心脏和肝脏中存在
草酰乙酸结合NADH变为苹果酸，穿过内膜
苹果酸结合NAD+，变回草酰乙酸并成功转移电子生成NADH
草酰乙酸结合谷氨酸，生成天冬氨酸与α-酮戊二酸，天冬氨酸穿过内膜
天冬氨酸结合α-酮戊二酸，生成草酰乙酸与谷氨酸
注意：α-酮戊二酸与苹果酸逆向转运，谷氨酸与天冬氨酸逆向运输
NADH转换为2.5ATP
糖代谢
糖酵解
过程
葡萄糖+ATP→葡萄糖-6-磷酸
葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸
果糖-6-磷酸→果糖-1,6-二磷酸
果糖-1,6-二磷酸→甘油醛-3-磷酸+磷酸二羟丙酮
磷酸二羟丙酮→甘油醛-3-磷酸
甘油醛-3-磷酸+NAD+→1,3-二磷酸甘油酸
1,3-二磷酸甘油酸→3-磷酸甘油酸+ATP
3-磷酸甘油酸→2-磷酸甘油酸
2-磷酸甘油酸→磷酸烯醇式丙酮酸→烯醇式丙酮酸+ATP
分为两个阶段
第一阶段
葡萄糖裂解为两分子三碳糖，为准备阶段，有两次磷酸化反应
葡萄糖结合ATP生成葡萄糖-6-磷酸
果糖-6-磷酸结合ATP生成果糖-1,6-二磷酸
第二阶段
放能阶段，除了氧化还原反应外，还有两次底物水平磷酸化
3-磷酸甘油醛结合NAD+和Pi，生成1,3-二磷酸甘油酸和一分子NADH
1,3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油酸激酶催化下生成3-磷酸甘油酸和一分子ATP
磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸和一分子ATP
一分子葡萄糖生成两分子丙酮酸，两分子ATP和两分子NADH
丙酮酸的调节
磷酸果糖激酶（PFK）为最关键的限速酶
己糖激酶是第一个酶，调节糖酵解的入口
丙酮酸激酶，调节糖酵解的出口
三羧酸循环
过程
丙酮酸→乙酰CoA→柠檬酸→异柠檬酸→α-酮戊二酸→琥珀酰CoA→琥珀酸→延胡索酸→L-苹果酸→草酰乙酸→丙酮酸
ATP的生成
四次脱氢，两次脱羧
异柠檬酸→α-酮戊二酸+NADH+CO2
α-酮戊二酸→琥珀酰CoA+NADH+CO2
琥珀酸→延胡索酸+FADH2
L-苹果酸→草酰乙酸+NADH
脱氢生成三分子NADH一分子FADH2
脱羧生两分子CO2
每循环一次，产10个ATP
调节
柠檬酸合成酶是限速酶
异柠檬酸脱氢酶
α-酮戊二酸脱氢酶
乙酰CoA很关键
控制淀粉或糖原分解为葡萄糖的速度
控制酵解的反应速度
控制三羧酸循环的反应速度
生理意义
氧化供能，产生CO2和H2O
糖、脂肪、氨基酸三大营养素分解的最终代谢通路
三大营养素相互转变的联系枢纽，将各种有机物的代谢联系起来，是中心环节，为其他物质合成提供碳骨架
戊糖磷酸途径
两个阶段
氧化反应生成NADPH和CO2
非氧化阶段包括一系列基团转移反应
意义
产生大量的NADPH，作为主要的供氢体，为脂肪酸、固醇、四氢叶酸等的合成，为细胞的各种合成反应提供主要的还原力
中间产物从三碳糖到七碳糖，为许多化合物的合成提供原料
是植物光合作用中O2合成葡萄糖的部分途径
NADPH用于供能，主要用于还原反应，其电子通常不经电子传递链传递，不用于ATP合成
糖异生
从非糖物质合成葡萄糖
位于细胞线粒体内，由丙酮酸生成葡萄糖
糖异生与糖酵解的异同
糖异生过程基本是糖酵解的逆过程
不同主要表现在三个不可逆步骤
丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸进入线粒体，在丙酮酸羧化酶作用下变为草酰乙酸
草酰乙酸在苹果酸脱氢酶帮助下变为苹果酸，到达细胞液
苹果酸再在苹果酸脱氢酶作用下变回草酰乙酸
草酰乙酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化下，变为磷酸烯醇式丙酮酸
果糖-1,6-二磷酸变为果糖-6-磷酸
果糖-1,6-二磷酸酶催化
葡萄糖-6-磷酸变为葡萄糖
葡萄糖-6-磷酸酶催化
糖异生发生在胞液和线粒体，而糖酵解只发生在胞液
协调调控
高浓度的果糖-6-磷酸抑制己糖激酶，活化果糖-6-磷酸酶，抑制糖酵解，促进糖异生
糖酵解和糖异生的控制点在F-6-G与F-1,6-2P之间的转化，酵解的酶是磷酸果糖激酶，异生的酶是F-1,6-2P酶；ATP促进糖酵解，柠檬酸促进糖异生
一个开放则另一个关闭，避免无数循环
乙酰CoA过量时，促进葡萄糖生成
胰岛素加强酵解，肾上腺素、胰高血糖素促进异生
生理意义
维持血糖浓度恒定
补充肝糖原
调节酸碱平衡
依赖于酵解和异生途径中的底物循环
乙醛酸循环
仅在植物和微生物中存在，作为三羧酸循环的补充
过程
乙酰CoA结合草酰乙酸生成柠檬酸，柠檬酸变为异柠檬酸
异柠檬酸裂解酶将其裂解为乙醛酸和琥珀酸
乙醛酸在苹果酸合酶的催化下，与乙酰CoA结合生成苹果酸
苹果酸脱氢形成草酰乙酸
即两分子乙酰CoA生成一分子琥珀酸
生理意义
可以使脂肪酸的降解产物乙酰CoA经草酰乙酸转化成葡萄糖，供给种子萌发时对糖的需要
提高了生物利用乙酰CoA的能力，不断产生琥珀酸
糖原的分解与合成
糖原的降解
酶
糖原磷酸化酶
限速酶
转移酶
糖原脱支酶
糖原的生物合成
酶
糖原磷酸化酶、糖原合酶、糖原分支酶
糖原合酶是限速酶
脂代谢
β氧化
在酯酰辅酶A的β碳原子上进行，包括脱氢、加水、再脱氢和硫解
生成一分子乙酰CoA和一分子少了两个碳的酯酰CoA，后者继续进行分解
在ATP供能下，脂肪酸在胞液中被酯酰辅酶A合酶催化活化为酯酰CoA
β氧化是主要产能方式之一
一次循环产一分子乙酰CoA，一分子NADH，一分子FADH2
酮体
由乙酰CoA形成的乙酰乙酸、丙酮以及β-羟丁酸，统称为酮体，正常人体内也有少量的酮体
只有在糖代谢和脂代谢紊乱时，肝脏中的酮体上升
肝脏没有利用酮体的酶，肝内生酮肝外用
胆固醇的代谢
乙酰CoA→甲羟戊酸→异戊烯衍生物→鲨烯→羊毛固醇→胆固醇
限速酶：HMG-CoA还原酶
合成部位：肝脏的胞液、内质网
氮代谢
氨基酸代谢
氨基酸的脱氨基作用
氧化脱氨：先脱氢再水解
氧化酶
脱氢酶
转氨作用
由转氨酶催化
联合脱氨
以谷氨酸脱氢酶为中心的联合脱氨
α-氨基酸+α-酮戊二酸→α-酮酸+谷氨酸
α-酮酸的代谢
经氨基化生成非必需氨基酸
转变成糖和脂类
除亮氨酸和赖氨酸是生酮氨基酸，其他都是生糖氨基酸，异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸都是生糖兼生酮氨基酸
氧化供能
氨基酸的脱羧作用
氨基酸脱羧酶
氨的转运
来源
氨基酸脱氨基作用生成氨是氨的主要来源
肠道内生成的氨
肾脏产生的氨
转运
以丙氨酸及谷氨酰胺的形式运输
谷氨酰胺转运
丙氨酸-葡萄糖循环
排泄
直接排泄
排氨动物将氨以谷氨酰胺的形式运输至排泄部位，经过分解释放NH3，游离的NH3直接通过扩散作用排出体外
合成尿素排泄
尿素循环
合成部位在肝细胞
循环过程
鸟氨酸+氨甲酰磷酸→瓜氨酸
在线粒体内
瓜氨酸+天冬氨酸→精氨琥珀酸→延胡索酸+精氨酸
胞液内
精氨酸+H2O→尿素+鸟氨酸
胞液内
氨基甲酰磷酸合成酶I合成氨基甲酰磷酸，提供氨基
天冬氨酸提供第二个氨基
精氨琥珀酸合成酶是限速酶
生理意义
对哺乳动物来说，是接触氨毒性的主要方式
对植物来说，可以解除氨毒性，还可以将尿素作为氨素的贮存、运输形式，当需要时可利用脲酶将其水解放出NH3，再次被利用
代谢调控
糖、脂肪、氨基酸和核苷酸代谢之间的相互联系
在能量代谢上相互联系
糖、脂、蛋白质代谢之间的相互联系，三羧酸循环是糖、脂、蛋白质最后分解的共同途径
联系几个代谢的化合物
葡萄糖-6-磷酸
丙酮酸
乙酰辅酶A
磷酸二羟丙酮
代谢反应在细胞内隔离分布
代谢调节
细胞水平调节
体现在细胞内酶的分布，关键酶的变构调节
关键酶
特点
催化反应速度最慢
催化单向反应或非平衡反应
受底物和代谢物或效应剂调节
多细胞整体调节
激素调节
神经调节
分子水平调节
基因表达调控
基本原理
基因表达是多级水平上进行的复杂事件
基因转录激活调节基本要素
特异DNA序列
调节蛋白
DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用
RNA聚合酶
原核基因转录调节
特点
σ因子决定RNA聚合酶识别特异性
操纵子模型具有普遍性
阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性
乳糖操纵子调节机制
其他转录调节机制
基因转录激活调节基本要素：见上
真核基因转录调节
顺式作用元件
启动子
增强子
沉默子
反式作用因子
基本转录因子、特异转录因子
mRNA转录激活及调节
实验技术
2D-Gel
2-DE
质谱
凝胶过滤柱层析
离子交换柱层析
盐析
透析
固相法合成蛋白质
电泳
琼脂糖电泳
PAGE电泳
sanger反应和sanger法测序
western blot
ELISA
蛋白质纯化方法
蛋白质分子量测定方法