临床微生物检验第三章：病毒检验技术

本思维导图重点论述病毒学检验方法的基本原理、基本方法、检验步骤和实验的质量控制。在病毒学检验各论中，对我国居民健康危害较大的病毒性疾病，从病毒的生物学特点、病毒分离培养、病毒感染的检测方法、临床表现、流行病学以及预防和治疗等方面进行了较全面介绍。干货满满，感兴趣的小伙伴可以收藏起来慢慢看呀！

病毒检验技术

形态学检查

一、电镜直接检查

快速诊断、研究病毒引起的组织和细胞病理变化

1、负染色电镜技术

常用

磷钨酸盐负染色技术

特点

高度反差、分辨力高、操作简便、不要求高纯度的标本

要求

①标本病毒含量高（≥10颗粒/ml）

②病毒需要游离于组织液或细胞液中

③病毒要有自身的形态特征

适用

腺病毒、轮状病毒、HAV、HBV、HSV、和CMV等检查

2、超薄切片电镜技术

原理

与病理切片技术相似

步骤

固定（锇酸或戊二醛）-包理-切片-染色（铀或铅复染）

特点

①组织细胞的超微结构

②细胞中病毒颗粒

③病毒在细胞内的生物合成和装配过程

④由病毒引起的细胞超微病理变化

要求

①特殊人员操作

②制作周期长、操作复杂

二、免疫电镜

1、抗原抗体作用复染直接电镜观察

原理

将病毒制成悬液，加入特异性抗体混匀，使标本 中病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察

特点

比电镜直接检查法更特异、更敏感，提高了病毒检出率

要求

①需要合适的抗体

②所用Ab效价必须高

③Ag/Ab比例合适

④标本中病毒颗粒达到一定程度

2、酶标记或胶体金标记免疫电镜技术

原理

以酶为抗原抗体反应标记物+相应底物=不溶性产物

以胶体金为抗原抗体反应标记物+电镜=电子散色力极强的终末产物

特点

比电镜直接抗原抗体作用分辨效果更佳

应用

目前已广泛用于各种电镜检查

非培养检验（免疫学）

一、免疫荧光技术

以显微镜观察胞核、胞浆内荧光，检测抗原在细胞内所处位置

直接法

荧光素标记在抗体上直接从标本中检查病毒抗原

间接法

用未经标记的特异性抗原中待检的抗原结合，然后滴加已标记荧光素的抗抗体

要求

标本有足够量的疑有病毒感染的完整细胞，或在组织培养出现明显CPE现象前检 查病毒抗原，以做早起诊断

应用

①具有胞核和胞浆内荧光

流感病毒、腺病毒和疱疹病毒等

②胞浆荧光

副流感、腮腺炎病毒

③多核巨细胞内荧光

麻疹病毒

二、酶免疫组化技术

染色体标本能长期保存，制剂可较长期应用，是一种较特异、简便方法

应用：主检测培养细胞中的病毒抗原和组织切片，印片细胞中病毒抗原，少用于临床病毒标本检测，原因是标本中可能含有内源性 H2O2酶产生非特异性染色，造成假阳性

该方法敏感性和特异性不如免疫荧光技术

三、ELISA

间接法、对抗夹心法、竞争法、捕获法

优点

价廉、快速简便、无需特殊设备、试剂比较稳定、可用机器判读结果，便于自动化和一次性检测大标本

可发现常规细胞培养难以增殖的病毒：如甲、乙、丙型肝炎病毒，轮状病毒

四、免疫胶体金技术

用胶体金作标记物，胶体金在合适条件下与病毒抗原或抗体形成稳定结合的标记物，但不影响被标记抗原或抗体的免疫活性，胶体金本身带有紫红色作为标志，可用肉眼直接观测结果

应用

轮状病毒、流感等病毒抗原的胶体金试剂盒应用于临床诊断

五、乳胶凝集实验

改法是一种间接凝集实验，即将抗原或抗体致敏胶乳颗粒，直接与待测标本中的抗原或抗体发生凝集反应

常用载体颗粒

聚苯乙烯乳胶

应用

轮状、巨细胞、乙肝病毒等

六、发光免疫分析

优点

灵敏度高、特异性强、快速检测，无放射危害作用

应用

甲乙丙型肝炎病毒、HIV、SARS冠状、肠道RNA病毒抗原检测

七、抗原检测

1、lgM特异抗体检测

感染机体后，特异性lgM抗体出现早，lgM抗体的测定有助于早起诊断，但感染机体产生lgM抗体有明显差异

应用

风疹、HAV、CMV、HSV、轮状病毒等早期诊断

2、lgG特异抗体检测

常用ELISA间接或捕获法，化学发光免疫测定

针对 尚无/难病毒培养方法辅助诊断、也是流行病学调查重要指标，并有助于了解个体既往感染

应用

于lgM一样

分类培养鉴定

简述

病毒分离培养是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即可确诊

不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性检出率低

病毒培养

一、细胞培养

1、原代细胞培养

原理

新鲜的组织或器官，在胰蛋白酶作用下先制成单个细胞悬液， 在充足的营养条件下，经37℃数天培养后形成单层细胞层

特点

保有组织特性，对病毒最敏感

2、二倍体细胞培养

原理

原代细胞在体外分裂50代后仍保持染色体的二倍体特征， 属正常细胞。

特点

这类细胞不能无限制连续传代，多次传代后出现细胞老化，敏感性降低

3、传代细胞培养

原理

来源于肿瘤细胞或二倍体细胞株传代过程中的变异细胞， 具有瘤细胞特性，繁殖率高可无限传代。常用人宫颈癌细胞......

特点

因源于肿瘤细胞，不宜用于疫苗的制备

对病毒敏感性高且稳定，可长期存活，生长旺盛，故常用于病毒的分离鉴定， 病毒抗原大量生产，抗病毒药物的=筛选研究

二、鸡胚培养

各病毒对鸡胚不同接种途径的敏感性不同

单纯疱疹-绒毛尿囊膜-斑点

流感-尿囊腔-鸡红血球凝集

腮腺炎病毒-羊膜腔-死亡

三、动物接种

动物的选择应考虑其对病毒的易感性、动物的健康状况、大小、性别和品系等

接种部位应随病毒种类而异、可有脑内、鼻内、皮内、皮下、腹腔、静脉接种等

接种后，每日观察和记录动物发病情况，若动物濒临死亡，则在死亡前取病变部位继续传代和鉴定

鉴定指标：

1、CEP细胞病变

病毒在敏感细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，可用光学显微镜观察

常见病变

①细胞圆缩、分解、溶解

肠道、鼻、披膜及痘病毒

②细胞融合成多核巨细胞

疱疹、副粘病毒、RSV

③细胞肿胀，颗粒增多，病变细胞聚集成葡萄串状， 提示腺病毒感染

④形成包涵体

狂犬病毒、CMV

2、红细胞吸附

带有血凝素刺突的病毒感染细胞后，细胞膜表面可出现HA（血凝素）， 能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞，常做病毒增殖指标

3、干扰现象

某些病毒感染细胞后不出现CPE，但能干扰在其后感染同一细胞的另一病 毒增殖，从而抑制后者所有的CPE。

4、细胞代谢的改变

使得培养基的PH改变

病毒的感染性和数量测定

1

TCLD50（50%组织细胞感染量测定）

2

红细胞凝集实验

3

空斑形成实验

4

中和实验