临床微生物检验第三章：病毒检验技术

本思维导图重点论述病毒学检验方法的基本原理、基本方法、检验步骤和实验的质量控制。在病毒学检验各论中，对我国居民健康危害较大的病毒性疾病，从病毒的生物学特点、病毒分离培养、病毒感染的检测方法、临床表现、流行病学以及预防和治疗等方面进行了较全面介绍。干货满满，感兴趣的小伙伴可以收藏起来慢慢看呀！

病毒检验技术

• 形态学检查
  • 一、电镜直接检查
    • 快速诊断、研究病毒引起的组织和细胞病理变化
    • 1、负染色电镜技术
      • 常用
        • 磷钨酸盐负染色技术
      • 特点
        • 高度反差、分辨力高、操作简便、不要求高纯度的标本
      • 要求
        • ①标本病毒含量高（≥10颗粒/ml）
        • ②病毒需要游离于组织液或细胞液中
        • ③病毒要有自身的形态特征
      • 适用
        • 腺病毒、轮状病毒、HAV、HBV、HSV、和CMV等检查
    • 2、超薄切片电镜技术
      • 原理
        • 与病理切片技术相似
      • 步骤
        • 固定（锇酸或戊二醛）-包理-切片-染色（铀或铅复染）
      • 特点
        • ①组织细胞的超微结构
        • ②细胞中病毒颗粒
        • ③病毒在细胞内的生物合成和装配过程
        • ④由病毒引起的细胞超微病理变化
      • 要求
        • ①特殊人员操作
        • ②制作周期长、操作复杂
  • 二、免疫电镜
    • 1、抗原抗体作用复染直接电镜观察
      • 原理
        • 将病毒制成悬液，加入特异性抗体混匀，使标本 中病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察
      • 特点
        • 比电镜直接检查法更特异、更敏感，提高了病毒检出率
      • 要求
        • ①需要合适的抗体
        • ②所用Ab效价必须高
        • ③Ag/Ab比例合适
        • ④标本中病毒颗粒达到一定程度
    • 2、酶标记或胶体金标记免疫电镜技术
      • 原理
        • 以酶为抗原抗体反应标记物+相应底物=不溶性产物
        • 以胶体金为抗原抗体反应标记物+电镜=电子散色力极强的终末产物
      • 特点
        • 比电镜直接抗原抗体作用分辨效果更佳
      • 应用
        • 目前已广泛用于各种电镜检查
• 非培养检验（免疫学）
  • 一、免疫荧光技术
    • 以显微镜观察胞核、胞浆内荧光，检测抗原在细胞内所处位置
    • 直接法
      • 荧光素标记在抗体上直接从标本中检查病毒抗原
    • 间接法
      • 用未经标记的特异性抗原中待检的抗原结合，然后滴加已标记荧光素的抗抗体
    • 要求
      • 标本有足够量的疑有病毒感染的完整细胞，或在组织培养出现明显CPE现象前检 查病毒抗原，以做早起诊断
    • 应用
      • ①具有胞核和胞浆内荧光
        • 流感病毒、腺病毒和疱疹病毒等
      • ②胞浆荧光
        • 副流感、腮腺炎病毒
      • ③多核巨细胞内荧光
        • 麻疹病毒
  • 二、酶免疫组化技术
    • 染色体标本能长期保存，制剂可较长期应用，是一种较特异、简便方法
    • 应用：主检测培养细胞中的病毒抗原和组织切片，印片细胞中病毒抗原，少用于临床病毒标本检测，原因是标本中可能含有内源性 H2O2酶产生非特异性染色，造成假阳性
    • 该方法敏感性和特异性不如免疫荧光技术
  • 三、ELISA
    • 间接法、对抗夹心法、竞争法、捕获法
    • 优点
      • 价廉、快速简便、无需特殊设备、试剂比较稳定、可用机器判读结果，便于自动化和一次性检测大标本
      • 可发现常规细胞培养难以增殖的病毒：如甲、乙、丙型肝炎病毒，轮状病毒
  • 四、免疫胶体金技术
    • 用胶体金作标记物，胶体金在合适条件下与病毒抗原或抗体形成稳定结合的标记物，但不影响被标记抗原或抗体的免疫活性，胶体金本身带有紫红色作为标志，可用肉眼直接观测结果
    • 应用
      • 轮状病毒、流感等病毒抗原的胶体金试剂盒应用于临床诊断
  • 五、乳胶凝集实验
    • 改法是一种间接凝集实验，即将抗原或抗体致敏胶乳颗粒，直接与待测标本中的抗原或抗体发生凝集反应
    • 常用载体颗粒
      • 聚苯乙烯乳胶
    • 应用
      • 轮状、巨细胞、乙肝病毒等
  • 六、发光免疫分析
    • 优点
      • 灵敏度高、特异性强、快速检测，无放射危害作用
    • 应用
      • 甲乙丙型肝炎病毒、HIV、SARS冠状、肠道RNA病毒抗原检测
  • 七、抗原检测
    • 1、lgM特异抗体检测
      • 感染机体后，特异性lgM抗体出现早，lgM抗体的测定有助于早起诊断，但感染机体产生lgM抗体有明显差异
      • 应用
        • 风疹、HAV、CMV、HSV、轮状病毒等早期诊断
    • 2、lgG特异抗体检测
      • 常用ELISA间接或捕获法，化学发光免疫测定
      • 针对 尚无/难病毒培养方法辅助诊断、也是流行病学调查重要指标，并有助于了解个体既往感染
      • 应用
        • 于lgM一样
• 分类培养鉴定
  • 简述
    • 病毒分离培养是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即可确诊
    • 不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性检出率低
  • 病毒培养
    • 一、细胞培养
      • 1、原代细胞培养
        • 原理
          • 新鲜的组织或器官，在胰蛋白酶作用下先制成单个细胞悬液， 在充足的营养条件下，经37℃数天培养后形成单层细胞层
        • 特点
          • 保有组织特性，对病毒最敏感
      • 2、二倍体细胞培养
        • 原理
          • 原代细胞在体外分裂50代后仍保持染色体的二倍体特征， 属正常细胞。
        • 特点
          • 这类细胞不能无限制连续传代，多次传代后出现细胞老化，敏感性降低
      • 3、传代细胞培养
        • 原理
          • 来源于肿瘤细胞或二倍体细胞株传代过程中的变异细胞， 具有瘤细胞特性，繁殖率高可无限传代。常用人宫颈癌细胞......
        • 特点
          • 因源于肿瘤细胞，不宜用于疫苗的制备
          • 对病毒敏感性高且稳定，可长期存活，生长旺盛，故常用于病毒的分离鉴定， 病毒抗原大量生产，抗病毒药物的=筛选研究
    • 二、鸡胚培养
      • 各病毒对鸡胚不同接种途径的敏感性不同
      • 单纯疱疹-绒毛尿囊膜-斑点
      • 流感-尿囊腔-鸡红血球凝集
      • 腮腺炎病毒-羊膜腔-死亡
    • 三、动物接种
      • 动物的选择应考虑其对病毒的易感性、动物的健康状况、大小、性别和品系等
      • 接种部位应随病毒种类而异、可有脑内、鼻内、皮内、皮下、腹腔、静脉接种等
      • 接种后，每日观察和记录动物发病情况，若动物濒临死亡，则在死亡前取病变部位继续传代和鉴定
      • 鉴定指标：
        • 1、CEP细胞病变
          • 病毒在敏感细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，可用光学显微镜观察
          • 常见病变
            • ①细胞圆缩、分解、溶解
              • 肠道、鼻、披膜及痘病毒
            • ②细胞融合成多核巨细胞
              • 疱疹、副粘病毒、RSV
            • ③细胞肿胀，颗粒增多，病变细胞聚集成葡萄串状， 提示腺病毒感染
            • ④形成包涵体
              • 狂犬病毒、CMV
        • 2、红细胞吸附
          • 带有血凝素刺突的病毒感染细胞后，细胞膜表面可出现HA（血凝素）， 能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞，常做病毒增殖指标
        • 3、干扰现象
          • 某些病毒感染细胞后不出现CPE，但能干扰在其后感染同一细胞的另一病 毒增殖，从而抑制后者所有的CPE。
        • 4、细胞代谢的改变
          • 使得培养基的PH改变
  • 病毒的感染性和数量测定
    • 1
      • TCLD50（50%组织细胞感染量测定）
    • 2
      • 红细胞凝集实验
    • 3
      • 空斑形成实验
    • 4
      • 中和实验