色谱分析法基本理论

仪器分析色谱分析法基本理论，对照PPT制作。色谱分析法是以试样各组分在固定相和流动相间的吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据，而建立起来的各种物理或物理化学分离分析方法。

色谱分析法基本理论

• 概论
  • 色谱法(chromatography)：
    • 以试样各组分在固定相和流动相间的吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据，而建立起来的各种物理或物理化学分离分析方法。
  • 色谱法的起源
    • 色谱分析法早在1906年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。
  • 将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。 这种分离方法被命名为色谱法(chromatography)。
  • 色谱法的优缺点
    • 分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化。
    • 定性能力较差
• 第一节 色谱分析法概述
  • 色谱法的分类
    • 1. 按两相状态分类
    • 2. 按分离机制分类
      • 吸附色谱法
        • 利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法
      • 分配色谱法
        • 利用固定液对不同组分溶解度的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法
      • 离子交换色谱法
        • 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法
      • 分子排阻色谱法
        • 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或分子排阻色谱法
    • 3. 按操作形式分类
      • 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱法。
      • 固定相呈平板状的色谱，称为平面色谱法
        • 薄层色谱法
        • 薄膜色谱法
        • 纸色谱法
  • 色谱法的发展
    • 在色谱发展史上占有重要地位的是：英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格) 他们发明液-液分配色谱；提出色谱塔板理论；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。 1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。
    • 1. 发展历史
      • 1952年Martin和James A T发明气相色谱法; 1956年范第姆特(Van Deemter)等人发表了描述色谱过程的速率理论; 1956年Go1ay提出了开管柱色谱理论; 20世纪60年代推出气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)；70年代高效液相色谱法(HPLC)迅速崛起 ; 20世纪80年代相继出现液相色谱的各种联用技术；还诞生了超临界流体色谱(SFC)；80年代末毛细管电泳法(CE)飞速发展。
    • 2. 发展趋势
      • 1) 开发新型固定相和检测器
      • 2) 建立和完善色谱联用技术
      • 3) 色谱新方法新技术的研究
      • 4) 分析自动化智能化
• 第二节 色谱流出曲线及有关概念
  • 1.色谱过程
    • 该过程主要利用试样中各组分在固定相和流动相间具有不同的溶解和解析能力；或不同的吸附和脱附能力；或其它亲和性能的差异
  • 2.色谱流出曲线
    • 1)色谱流出曲线
      • 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线，或色谱图。
    • 2)基线
      • 当色谱柱没有组分仅有流动相进入检测器时，在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。稳定的基线应该是一条水平直线（或当只有流动相通过检测器时产生的噪声信号是直线）。
    • 3)色谱峰
      • 色谱流出曲线上突起的部分就是色谱峰。正常的色谱峰是对称的。
    • 4)拖尾因子T
      • 用于衡量色谱峰的对称性
      • 对称的色谱峰，T应在0.95～1.05之间。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
  • 3.色谱峰区域宽度
    • 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法
    • 1)标准差
      • 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。
    • 2)半峰宽W1/2
      • 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准差的关系为 W1/2=2.355
    • 3)峰宽W
      • 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 W=4 =1.699W1/2
  • 4.定性参数—— 保留值
    • 1)保留时间tR
      • 试样从进样到柱后出现浓度极大点时所经过的时间，称为保留时间。
      • tR实际上是组分在固定相中保留的总时间，包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间。
      • 保留时间是柱色谱法定性的基本依据。
    • 2)死时间t0
      • 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。
      • 测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即 ū = L/t0
      • 测定：GC——空气；LC——烷烃或醇
    • 3)调整保留时间t'R
      • 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即t'R = tR  t0
      • t'R实际上是组分在固定相中滞留的时间。
    • 4)保留体积VR
      • 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系： VR= tR FC
    • 5)死体积V0
      • 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速FC（cm3·min-1）计算。 V0 = t0FC
      • 仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。
    • 6)调整保留体积VR
      • 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保 留体积。 VR= VR  V0 = tR FC
    • 7)相对保留值r2,1
      • 两组分调整保留值的比值，称为相对保留值，也可以是分配系数、保留因子之比。 r2,1= tR2/ tR1= K2 / K1=k2 / k1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速等无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。
    • 8)保留指数Ix
      • 保留指数把物质的保留行为用邻近其的两个正构烷烃来标定，并以均一标度表示。I只与固定相和温度有关，只要两者保持相同，在任何仪器及相同液相制备的任何柱上，在相同温度测得的I应相同。 在GC中又称Kovasts指数，已推广到HPLC，采用正构烷基苯为标准物。
  • 5.定量参数
    • 峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。
    • 峰面积：以A表示，A=1.065*h*W1/2。
  • 6.相平衡参数
    • 1)分配系数K
      • 样品组分分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。
      • 它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 K=Cs / Cm
      • 在一定条件（固定相、流动相、温度）下，分配系数是组分的特征常数。
    • 2)保留因子k
      • 在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比，又称分配比、容量因子，其表达式为：
      • 容量因子是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数
    • 3)保留值与保留因子、分配系数的关系
      • 在色谱柱一定时，Vs、Vm一定，若温度、流速一定，则t0一定，此时tR（VR）仅取决于保留因子k或分配系数K。组分的K越大，k值也大，在柱中滞留时间长，较晚流出色谱柱。
      • 两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。
  • 7.分离参数
    • 分离度R 是相邻两组分色谱峰的保留时间之差与两色谱峰平均峰宽的比值，即峰间距比平均峰宽，又称分辨率。通常用R≥1.5作为相邻两组分完全分离的标志。
  • 8.等温线与色谱峰形的关系
    • 在一定条件下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时，在两相间浓度的比值K为常数(K= Cs/ Cm ),由此绘制的Cs-Cm关系曲线应为一条直线，称为等温线，如图中曲线a所示。
    • 线性等温线为K固定不变时得到的理想等温线，对应的色谱峰为正常峰（对称峰）。但在实际分析中，完全对称的色谱峰很少，一般只能得到非线性等温线，如图中曲线b或曲线c所示，曲线b为凸形等温线，产生拖尾峰；曲线c为凹形等温线，产生前延峰。
• 第三节 色谱法基本理论
  • 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。
  • 下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。( KA > KB)
    • 图中KA>KB ，因此，A组分在移动过程中滞后。 若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点： 第一，两组分的分配系数必须有差异； 第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度； 第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。
    • 第一、二点是完全分离的必要条件。 作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。 塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。
  • 1. 塔板理论
    • 把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。
    • 1) 塔板理论的基本假设：
      • (i)在柱内一小段长度内，组分可以在两相间迅速达到平衡。
      • (ii)以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积(ΔVm)。
      • (iii)所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴(纵)向扩散可忽略。
      • (iv)分配系数在所有塔板上是常数。
    • 2)理论塔板高度和理论塔板数
      • 简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。每层塔板的高度（或每达到一次分配平衡所需的柱长）称为理论塔板高度(height equivalent to a theoretical plate)，用H表示。溶质平衡的次数则为理论塔板数(number plate)，用n表示 。
      • 对于一根长为L的色谱柱，将理论塔板高度H定义为单位柱长的方差，即：溶质平衡的次数即理论塔板数n应为： n = L / H与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。
      • n与半峰宽及峰底宽的关系式为：从公式可以看出，在tR 一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。
    • 3)有效板高和有效板数
      • 在实际工作中，常用有效塔板数neff表示柱效：
    • 塔板理论的成就和局限性
      • 当色谱柱长度一定时，塔板数 n越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。
      • 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
      • 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。
      • 塔板理论无法解释谱带展宽的原因；无法解释柱效与流动相流速的关系；也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
      • 贡献：用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数
      • 局限：色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关。
  • 2. 速率理论
    • 1956年荷兰学者Van Deemter(范第姆特)提出。
    • 在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素
    • 1)速率理论方程（Van Deemter方程） Van Deemter方程的数学表达式为：H = A + B / u + C u
      • 式中u为流动相的线速度；A、B、C为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。
      • 影响H的动力学因素
        • 涡流扩散项A(eddy diffusion)　也称为多径项
          • 涡流扩散 原因：柱填充不均匀A=2dpA：涡流扩散系数，其单位为cm。：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形状决定。dp：填料 (固定相) 颗粒的平均直径，dp小，A小；但dp太小， 和柱阻大。
        • 纵向扩散项B/u(longitudinal diffusion)　也称为分子扩散项。
          • 原因：浓度差组分向“塞子”前后扩散，使区带展宽。影响因素：u ， B=2DmB：纵向扩散系数，其单位为cm2/s。：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散的阻碍。 Dm：组分在流动相中的扩散系数。
        • 传质阻力系数C包括流动相传质阻抗系数Cm和固定相传质阻抗系数Cs两项，即 C = Cm+ Cs 由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。
          • 流动相传质过程是指试样组分从流动相移动到固定相表面的过程。对于填充柱，流动相传质阻力系数Cm为： Cm= fm (k) dp2 / Dm 由上式看出， Cm与dp2成正比，与Dm成反比。 因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的流动相，可使Cm减小，提高柱效。
          • 固定相传质过程是指试样组分从固定相表面移动到固定液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回界面的传质过程。固定相传质阻力系数 Cs为： Cs = q  k / (1 + k)2  df2 / Ds 由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在固定相的扩散系数Ds大，则固定相相传质阻力就小。 一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。虽然提高柱温可增大Ds，但会使k值减小，为了保持适当的Cs值，应控制适宜的柱温。
    • 2)气相色谱的速率理论方程
      • 气-液填充柱：H = A + B/u + Cu C = Cg+ Cl≈ Cl
      • 开管毛细管柱(Golay方程)： H = B/u + Cgu+C1u
    • 3)液相色谱的速率理论方程
      • H = A + B/uA = 2λdp ；C = Cmu+ Csmu+ Csu纵向扩散项可以忽略的原因：B = 2γDm Dm ∝ T/ Ƞ
    • 4)影响柱效的主要变量
      • 流动相速度u
        • 根据Van Deemter方程分别作LC和GC的H-u图，LC(a)和GC(b)的H-u图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点。
        • LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多。
        • LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。
        • 以GC为例讨论u对柱效的影响：
          • 载气流速较高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速 ，柱效。
          • 载气流速较低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。
      • 填料粒径
        • 色谱柱填料粒径对柱效的影响是至关重要的。 实验表明不同填料粒径，H-u曲线也不同（见图）：粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。
      • 色谱柱柱温
        • 柱温变化对色谱过程分子扩散和传质的影响是矛盾的： 柱温升高，Dm、Ds增大，纵向扩散使柱效降低；而改善传质使柱效提高。 应根据色谱系统性质，判断引起色谱峰扩张的主要因素是分子扩散或传质，选择合适柱温。
  • 3. 色谱分离方程式
    • 反映了分离度与柱效(n)、分离因子(α)及保留因子(k)之间的关系。式中，a为柱效项，影响色谱峰的峰宽；b为柱选择项，影响峰间距；c为柱容量相，影响色谱峰的峰位。k2为色谱图上相邻两组分中晚出峰组分的保留因子(k2>k1), a为分离因子，a=k2/k1=k2/k1>1。
    • n、k、α对分离度的影响如图所示，增大n，使峰变窄而改善分离度，tR不变；增加k，分离度增加，但峰变宽且tR增大；提高α，分离选择性增加，峰间距增大，显著提高分离度。因此，要获得满意的分离度，就需要提高n、α及k，一般通过选择适宜的固定相、流动相、柱温、流速等条件，使混合物各组分在尽可能短的时间内获得良好的分离(R>1.5)。
    • 色谱分离条件的优化
      • 1.提高理论塔板数
        • (1)适当增加柱长
        • (2)降低塔板高度
      • 2.调节、控制保留因子
      • 3.提高分离因子
        • (1)改变流动相的组成
        • (2)改变柱温
        • (3)改变固定相
  • 4. 色谱方法的选择及系统适应性试验
    • 色谱方法的选择
      • 气体、挥发性、热稳定的试样采用GC;
      • 非挥发性试样采用HPLC;
      • 非挥发性试样但能通过衍生化成为挥发性试样也可采用GC；
      • 既可用气相色谱、也可用高效液相色谱分析的试样，通常首选气相色谱，以降低分析成本。
    • 系统适应性试验
      • 色谱系统适应性试验参数：
        • 1)理论塔板数n：评价柱分离效能，要求大于规定值。
        • 2)分离度R：评价柱总分离效能，要求大于1.5。
        • 3)重复性：连续进样，要求峰面积的RSD≤2.0%。
        • 4)拖尾因子T：评价色谱峰的对称性，要求在0.95~1.05。
        • 5）灵敏性。
• 第四节 色谱定性、定量分析方法
  • 1. 定性分析
    • 定性依据：
      • 根据保留值定性
      • 利用选择性检测响应定性
      • 通过两谱联用定性
      • 应用化学反应或物理吸附定性
    • 1)利用保留值定性
      • 对照品对照定性
        • 在相同的固定相和操作条件下，分别测出已知物和未知物的保留值。两者吻合则可判断未知组分可能是该已知物。
        • 前提
          • ①必须有标准品
          • ②对样品组分有一定了解
    • 2)利用选择性检测响应定性
    • 3)利用两谱联用定性
  • 2. 定量分析
    • 定量依据：在一定操作条件下，被分析物质的重量mi与检测器上产生的信号（峰面积或峰高）成正比。
    • mi∝Ai 或 mi ∝ hiA1/A2= m1/m2?A1/A2≠m1/m2
    • 原因：各物质在同一检测器上响应不同或同一物质在不同检测器上响应不同mi＝fi´×Ai 或 mi＝fi´×hi
    • 1)校正因子
      • 绝对校正因子f´i f´i ＝mi/Ai 单位峰面积所代表的物质的质量
        • 缺点：需使色谱条件高度重复，较困难
      • 相对校正因子fi
        • i — 样品，s — 标准物[GC：苯(TCD)；正庚烷(FID)] 将其它物质峰面积都校正成相当于这个标准物的峰面积。然后用校正的峰面积来计算物质的含量。
    • 2)定量方法
      • 归一化法
        • 前提：样品中所有组分都能流出柱且对检测器都有响应，同时已知各组分的fi。
        • 计算公式:
        • 如果样品中各组分的相对校正因子相近（如同系物）或只是粗略定量时，可约去校正因子，直接用峰面积归一化计算，称为不加校正因子的面积归一化法。计算公式为：
        • 优点：
          • a.简便，结果与进样量准确性无关，操作条件影响不大。
          • b.比其它方法易行。宜于进样量少不易测准的液体样品中多成分同时分析。
          • c.当分析同系物时可不求fi而直接把面积归一化。
        • 缺点：
          • a. 检测器上无信号的组分
          • b.无法求得fi的组分（未定性或峰重叠）
      • 外标法
        • 即以待测组分的标准品作对照物，与对照物对比求算待测组分含量的方法。
        • 优点：操作简便、计算方便、无需校正因子、只需被测组分出峰。
        • 前提：a.需严格控制进样体积 b.操作条件稳定
        • a.工作曲线法(标准曲线法)
          • 要求：r ≥0.999，截距近似为零或较小。
        • b.外标一点法
          • 前提条件：工作曲线线性良好、过原点配一与被测组分含量接近的标样，分别进样。
          • 进样量相同：
          • HPLC最常用。
        • c.外标两点法
          • 工作曲线不过原点，两点校正。
          • A1=am1+b A1=aC1+bA2=am2+b 或 A2=aC2+bmx=(Ax-b)/a Cx=(Ax-b)/a
          • TLCs常用
      • 内标法
        • 前提：有适合的内标物
        • 对内标物的要求
          • a.样品中不含此成分
          • b.能单独出峰且能与组分完全分开
          • c.峰位置尽量靠近组分
          • d.内标物应为纯物质
        • 优点：
          • a.定量准确，与进样量的重复性无关。
          • b.只需被测组分和内标物出峰。
          • c.适于微量组分的分析。
        • 缺点：每次测定都要精确配制含内标的样品，且内标的选择也较难。
        • （1）内标校正因子法
          • fi、fs未知，可测fi,s
        • （2）内标工作曲线法
        • （3）内标对比法
          • 操作过程
            • 先配制一定浓度的标准品溶液，加一定量的内标 → 标准液 → 标准色谱图
            • 未知浓度的样品加等量内标 → 待测溶液 → 样品色谱图
          • GC常用（常选择正构烷烃做内标物）
        • （4）标准加入法
          • 用于分析复杂体系时消除基质效应的影响。
          • 优点：不需内标物，又具有内标法的优点，与进样量无关，只要两次进样实验条件恒定即可，尤其适用于低浓度多组分样品的定量分析。
    • 色谱定量分析的方法学评价指标
      • 色谱条件优化 满足系统适用性试验分离度、理论板数、重复性和拖尾因子等要求。
      • 专属性 确定测定信息是否为被测组分的专属响应。
      • 线性关系 确定被测组分的浓度或质量与响应信号是否呈线性关系，并确定其线性范围。一般要求标准曲线的相关系数r≥0.999。
      • 耐用性 测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
      • 精密度 包含重复性、中间精密度和重现性。重复性要求平均含量的RSD≤3%。
      • 准确度 一般用加样回收试验，要求回收率在95%～105%，RSD<3%（生物样品除外）。