导图社区 蛋白质的性质、分离纯化和鉴定
朱圣庚第四版生物化学的知识梳理。利用溶解度、分子大小、所带电荷、相互作用分离。等电点沉淀、盐溶盐析、有机溶剂沉淀、加热沉淀、凝胶过滤层析、凝胶电泳……纯化流程,评估,具体技术
编辑于2021-05-12 19:41:54生物化学第一张蛋白质的结构与功能思维导图笔记,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础,但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。
朱圣庚第四版生物化学的知识梳理。利用溶解度、分子大小、所带电荷、相互作用分离。等电点沉淀、盐溶盐析、有机溶剂沉淀、加热沉淀、凝胶过滤层析、凝胶电泳……纯化流程,评估,具体技术
生物化学第四版考研章节重点知识梳理。蛋白质结构预测是近几十年来的研究热点,理论方法使人们深入了解了实验难以处理的蛋白质结构。同时,随着测定蛋白质结构的实验方法的改进,大量高质量蛋白质结构数据可供研究,提高了训练数据的质量和预测算法的准确性。最终的研究目标是利用蛋白质的序列准确地预测蛋白质的三维结构。
社区模板帮助中心,点此进入>>
生物化学第一张蛋白质的结构与功能思维导图笔记,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础,但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。
朱圣庚第四版生物化学的知识梳理。利用溶解度、分子大小、所带电荷、相互作用分离。等电点沉淀、盐溶盐析、有机溶剂沉淀、加热沉淀、凝胶过滤层析、凝胶电泳……纯化流程,评估,具体技术
生物化学第四版考研章节重点知识梳理。蛋白质结构预测是近几十年来的研究热点,理论方法使人们深入了解了实验难以处理的蛋白质结构。同时,随着测定蛋白质结构的实验方法的改进,大量高质量蛋白质结构数据可供研究,提高了训练数据的质量和预测算法的准确性。最终的研究目标是利用蛋白质的序列准确地预测蛋白质的三维结构。
蛋白质的性质、分离纯化和鉴定
蛋白质在水溶液中的行为
蛋白质的酸碱性质
所有的天然球状蛋白质处于变性状态时,可解离基团全部可被滴定
蛋白质的滴定曲线形状和等电点,在有中性盐存在下可以发生明显的变化。这是由于蛋白质分子中的某些解离基团可以与中性盐中的阳离子如Ca*、Mg2*或阴离子如CI、HPO2相结合,因此观察到的蛋白质等电点在一定程度 上决定于介质中离子的组成
蛋白质的胶体性质
蛋白质分子表面的亲水基团,如—NH2、—COOH、—OH以及—CO—NH—等,在水溶液中能与水分子发生水化作用,使蛋白质分子表面形成一个水化层
蛋白质溶液由于蛋白质分子具有水化层与电荷两种稳定因素,所以作为胶体系统是相当稳定的,如无外界因素影响,就不致互相聚集而沉淀。蛋白质也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能透过半透膜
蛋白质的沉淀
盐析法
盐析沉淀一般不引起蛋白质的变性
加入大量中性盐:硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等
有机溶剂沉淀法
脱去水化层以及降低介电常数而增加异性电荷间的相互作用,使蛋白质容易聚集沉淀
可引起蛋白质变性
极性有机溶剂:甲醇、乙醇、丙酮
重金属盐沉淀法
pH大于等电点,蛋白质颗粒带负电,易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀
误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救原理如上
生物碱试剂和某些酸沉淀法
加热变性沉淀法
加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然构象解体,疏水基外露,因而破坏了水化层,同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态
我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点人少量盐卤(含MclL)的制互腐方法,这是成功应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活力,以增加单位蛋白质质量中所要蛋白质的含量或生物活性
前处理
分离纯化某一种蛋白质,首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,避免丢失生物活性
粗分级处理
当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。一般这一步的分级[分离]用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液不适于用沉淀法或盐析法依缩的,则可采用超过滤或凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。
细分级处理
纯化主要使用柱层析方法,包括凝胶过滤层析,离子交换层析,吸附层析以及亲和层析等。柱层析是基于蛋白质电荷、大小、结合亲和力和其他性质的不同获得分离的,是蛋白质分离纯化的最有力方法。必要时还可选择电泳法,如凝胶电泳、等电聚焦作进一步的纯化,但电泳法主要用于分析分离和纯度鉴定。
结晶
结晶过程本身伴随着.定程度的纯化,重结晶又可进步剔去少量夹杂的蛋白质。由于晶体中从未发现过变性蛋白质,因此蛋白质晶体不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的,只有获得蛋白质晶体才能对它进行X射线结构分析
蛋白质分离纯化的方法
分离纯化方法的根据
根据溶解度不同的分离方法
pH
离子强度
介电常数
温度
影响蛋白质溶解度的外部因素
但在同一特定的外部条件下,不同蛋白质具有不同溶解度,这是因为。溶解度归根结底取决于蛋白质本身的分子结构
内部因素/根本因素
等电点沉淀、盐析、有机溶剂分级分离、两相分配(如分配层析)和结晶
根据分子大小不同的分离方法
超过滤、凝胶过滤(分子筛)、超离心法(包括密度梯度离心
利用电荷不同的分离方法
电泳(包括纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、双向电泳等
离子交换层析
以疏水作用为基础的分离方法
疏水相互作用层析、SDS-PAGE、染料结合层析
基于对生物配基的亲和力的分离方法
亲和层析包括免疫亲和层析、凝集素亲和层析和染料亲和层析
吸附层析
等电点沉淀和盐析
等电点沉淀和pH控制
等电点时,溶解度达到最低点
蛋白质的盐溶和盐析
中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度,中性盐可以增加蛋白质的溶解度,这种现象称为盐溶。盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强,因而溶解度增高
当离子强度增加到足够高时例如饱和或半饱和的程度.很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加人使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质分子表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子也成盐离子的水化水,留下暴露出来的疏水基团。随着盐浓度的增加,蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。因此最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。盐析法是蛋白质分离过程中最常用的方法之一
有机溶剂分组分离
有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数
另一种方式可能与盐桥相似,与蛋白质直接争夺水化水,致使蛋白质聚集沉淀
透析和超滤
透析是利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖分开
超滤是利用压力或离心力,强行使水和其他小分子溶质通过半透膜,而蛋白质被。截留在膜上
密度梯度超速离心
凝胶过滤——大小排阻层析
凝胶过滤也称大小排阻层析、分子筛、凝胶渗透层析。它是根据多孔介质对不同大小和不同形状的分子的排阻能力不同来分离蛋白质混合物的
凝胶过滤的介质
凝胶过滤的原理和过程
当分子大小(和形状)不同的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内的网状结向而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外;比网孔小的分子则不同程度地能自由出人凝胶珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来,同样质量的分子,线型分子在前,球状分子在后
凝胶电泳
电泳原理
在外电场作用下,荷电颗粒将向着与其电荷符号。相反的电极移动
电泳类型
电泳过程
PAGE适于分离蛋白质和寡核苷酸
琼脂糖凝胶电泳用于核酸的分离
等电聚焦和双向电泳
等电聚焦
是一种高分辨率的蛋白质分离技术,它主要用于蛋白质等电点的测定。等电聚焦是在具有pH梯度的介质中进行是
双向电泳
有些混合物进行一次电泳不能完全分开。这种情况可在第一次电泳后,将凝胶条切下,旋转90º,通过凝胶之间的接触印迹把样品转移到新的凝胶板上,更换缓冲液,进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。
现在双向电泳多指等电聚焦和随后的SDS凝胶电泳相结合的分离技术。蛋白质第一次分离是在薄胶条上进行等电聚焦,然后把胶条水平向铺设在片状凝胶上用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二次分离。得到的双向电泳谱(凝胶板)上水平向分离反映pI的差别,垂直向分离反映分子质量的不同。因此双向电泳可以把分子质量相同而pI不同,或者pI相近而分子质量不同的蛋白质分离开来。双向电泳作为分析方法比任一种电泳单独使用都更灵敏,用双向电法可以把细胞的一套蛋白质分开
离子交换层析
疏水相互作用层析
亲和层析
亲和层析就是利用蛋白分子对其配体分子具有专一性识别功能或称生物学亲和力建立起来的一种有效的纯化方法
亲和层析的基本方法是把待分离的某一蛋白质的专一配体通过适当的化学反应共价连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面官能团上
当蛋白质混合物加到填有亲和载体的层析柱时,待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上,而其他的蛋白质(称杂蛋白)则因对该配体无专一的结合部位而不被吸附,它们通过洗涤即可除去,被专一结合的蛋白质可用含有相应的游离配体溶液把它从柱上洗脱下来(称为亲和洗脱)
优点:①它通常只需要一步的处理即可将某一含量少的所要蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度和产率还相当高;②可以在活性物质中除去化学和物理性质几乎完全相同,但已失活了的“杂质”,这一点对提高酶或其他生物活性物质的比活特别有用
高效液相层析
HPLC
蛋白质相对分子质量的确定
凝胶过滤测定相对分子质量
蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量,而是它的斯托克半径。如果某种蛋白质与一个非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积,则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径,称为斯托克半径
SDS-PAGE测定相对分子质量
蛋白质分子在介质中电泳时,它的迁移速率决定于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂+二烧基硫酸钠或同时加人少量巯基苏糖醇(或巯基乙西醇),则蛋白质分子的电冰迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与原来所带的电荷和分子形状无关
SDS是种变性剂,它能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水相互作用,而巯基苏糖醇能打开二硫键,因此在有SDS或同时有巯基苏糖醇存在下,蛋白质或亚基的多肽链处于展开状态。SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链通过疏水相互作用结合成复合体。SDS与蛋白质的结合带来了两个后果:第一,由于SDS是阴离子,使多肽链覆盖上相同密度的负电荷,该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别;第二,改变了蛋白质分子的天然构象,使大多数蛋白质分子呈同样的棒状形。因此在SDS存在下的电泳几乎是完全基于分子质量分离蛋白质的,多肽愈小迁移得愈快。电泳完毕,蛋白质可用染料如考马斯亮蓝显示
沉降速度法测定相对分子质量
质谱法
目前生物学质谱可以测定相对分子质量高达400000的生物大分子,精确度达0.001%~0.1%,远高于凝胶过滤法和SDS-PAGE法
蛋白质的含量测定与纯度测定
总蛋白质含量的测定
凯氏定氮法
双缩脲法
Folin-酚法
蛋白质标准测定法
紫外吸收法
胶体金测定法
灵敏度最高
特定蛋白质含量的测定
1.0单位的酶活力被定义为在最适测定条件下于25℃每分钟引起1.0μmol的底物转化为产物的酶量
酶的比活或比活力是每毫克总蛋白质中酶的单位数,比活是酶纯度的量度,在酶纯化过程中它不断增加,直至达到最大而不变,表明酶是纯的
一般纯化的每一步,活力和总蛋白量都会降低,活力降低是因为总有一些难以避免的损失,总蛋白降低是因为纯化目的就是为了尽可能多地去除不要的或非专一的蛋白质
总活力下降的同时比活力却在升高,一个蛋白质,当进一步纯化不再增加比活力并且用电泳等方法检测出一个蛋白条带时,则被认为是纯的
蛋白质纯度的测定
纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时,都将以单一的速度移动
HPLC常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定,高纯度蛋白质在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一对称的峰