导图社区 第三章 细胞生物学的研究方向
这是一个关于第三章 细胞生物学的研究方向的思维导图,包含了显微镜技术、细胞的分离和培养、细胞组分的分离和纯化技术等。
编辑于2023-12-06 13:52:10第三章 细胞生物学的研究方向
第一节 显微镜技术
显微镜发展简史
1590年,荷兰 Janssen ,第一台原始的显微镜 1610年,意大利伽利略,具有物镜、目镜和镜筒的复式显微镜 1611年,开普勒,显微镜的基本原理 1625年,法布尔,提出显微镜( microscope )一词 1665年,英国罗伯特.胡克,制造出能放大140倍的显微镜 1674年,荷兰安东尼.范.列文虎克,放大率270倍的显微镜 1684年,荷兰惠更斯,双透镜目镜一惠更斯目镜 19世纪中叶,恩斯特.阿贝提出了显微镜的完善理论 1902年,艾夫斯,现代双目镜 20世纪30年代,第一架电子显微镜诞生
光学显微镜技术
分辨率:能够区分相近两点的最小距离(分辨率越高显微镜成像能力越强) 衡量显微镜成像能力的主要指标 计算公式:α:标本对物镜镜口张角的半角,λ:照明光源的波长 n:聚光镜和物镜之间介质的折射率(空气约为1,油浸镜的镜油为1.3~1.5香柏油为1.5)
显微结构 (microscopic structure)普通光学显微镜的分辨率约为0.2μ m ,细胞核、染色体、叶绿体 超出光学显微镜分辨水平的细胞结构统称为超微结构 (ultrastructure) ,亚显微结构 (submicroscopic)
放大率:最大放大倍数=人眼分辨率/光镜分辨率=~100μ m /~0.2μ m ~500倍 超过以上的放大倍数不会提高分辨率,属于无限放大
标本制备技术
非切片法:不用切片机或不经过切片步骤而制成薄片 涂片法、铺片法、压片法、离析法、撕片法、磨片法
切片法:依靠手或切片机切成薄片的方法 徒手切片法、石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法
样本制作过程
取材
固定fixation
脱水dehydration
包埋embed
切片slicing
染色staining
观察
显微镜介绍
相差显微镜:原理:利用光的衍射和干涉效应,把透过标本不同区域的光波的光程差(相位差) 变成振幅差(明暗差),使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比;特殊结构:环状光阑,相位板; 用途:观察无色、透明、活细胞结构
暗视野显微镜:原理:散射光成像;特点:分辨率高;缺点:只能观察物体的轮廓,分辨不清内部的细胞结构
荧光显微镜fluorescence microscope—强反差的色彩图像;原理:以紫外线为光明照射物体,使之携带的荧光物质发射荧光; 用途:定性定量和定位的研究组织细胞内被荧光标记的物质,观察切片,或对活细胞内分子进行实时观察;特点:光源不直接照明,而是激发能源,需特殊的两种滤光片
共聚焦激光扫描显微镜confocal laser scanning microscope—高清晰彩色三维图像,达到光镜分辨率的理论值;用途:对细胞或组织平面进行无损伤的光学切片—细胞CT
超分辨光学显微镜super-resolution microscope—纳米尺度;超分辨显微技术;优点:非接触,无损伤,可观测内部结构;用途:活的细胞或组织,内部深层三维结构成像
倒置显微镜—活体观察
偏光显微镜polarizing microscope,在医学方面,鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等;细胞中的蛋白质纤维、纺锤体、胶原、染色体等也具有双折射性
微分干涉相差显微能显示结构的三维立体影像
电子显微镜
透射电子显微镜( transmission electron microscope , TEM )—观察超微结构,借助金属投影 metal shadowing 冰冻断裂 freeze - fracture 及冰冻蚀刻 freeze - etching 技术可获取三维图像
扫描电子显微镜( scanning electron microscope , SEM )—适于观察组织细胞表面或断面的三维立体结构
冷冻电镜技术( cryo - electron microscopy , cryo - EM )在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术
第二节 细胞的分离和培养
细胞分离
实体组织中:机械分散发、酶解法、激光捕获显微切割技术
液体环境中:离心法、流式细胞术、细胞电泳、免疫磁珠法
细胞培养
定义
无菌条件下,将细胞从体内分离,并模拟体内生理环境,在体外进行培养,使其能够继续生存生长和增殖的一种方法
分类
原代培养(primar culture)直接从体内获取的组织或细胞进行首次培养
传代培(secondary culture当原代细胞经增殖达到一定密度后,将细胞分散 从一个培养以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养
条件
培养基、活性物质或生长因子、水:三蒸水、温度:36℃-37℃ 气体:90%-95%O2,5%-10%CO2、 PH :7.2-7.4、细胞渗透压:260-320 mmol / L
特点
贴壁生长
接触抑制
细胞系
来源于恶性肿瘤组织的细胞,能够在体外无限繁殖、传代,如:HeLa细胞系
细胞株
用细胞克隆化的方法进一步改善细胞系的均一性,即分离出单个细胞使之增殖形成细胞群
细胞融合
又称细胞杂交,指两个或两个以上的细胞合成一个细胞的过程
第三节细胞组分的分离和纯化技术
细胞分离
分离步骤:①从组织中分离细胞,可采用机械分离法或消化法;②分离纯化单一类型的细胞,一般用密度梯度离心或流式细胞术等方法; ③破碎细胞,制备细胞匀浆液,可用匀浆法或超声波破碎法等;④根据实验目的分离采用不同的方法分离纯化具体的某种细胞组分或细胞器
细胞裂解
1、匀浆法:样品处理量大,效率高,速度快,对生物大分子破坏较少 2、化学裂解法:利用表面活性剂( SDS 、 TritonX -100等)、螯合剂( EDTA 等)、脂溶性溶剂(丙酮、氯仿、甲苯)等化学试剂使细胞膜裂解 3、反复冻融法:对存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效 4、超声波破碎法
细胞器及细胞组分的分级分离
差速离心:连续提高离心的转速、时间 密度梯度离心:用介质(氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖溶液)在离心管内形成连续或不连续的密度梯度
蛋白质的分离及鉴定
用层析的方法纯化蛋白质;用电泳的方法分析、鉴定蛋白质
核酸的分离纯化及鉴定
差速离心沉淀是核酸分离纯化的主要方法;凝胶电泳是鉴定核酸的主要方法
第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术
意义:形态与功能相结合是细胞生物学研究的突出特点,显示细胞内大分子、小分子甚至是无机离子在细胞内分布的分子示踪技术对细胞生物学的研究尤为重要
第五节 细胞功能基因组学研究技术
基因表达的定量分析
主要过程
① RNA 提取与电泳分离;②印迹;③杂交;④放射自显影分析
原位杂交
荧光实时定量 PCR 技术是检测基因表达变化的常规方法
体外培养的正常细胞的增殖能力不是是无限的,而 是有一定的界限 Hayflick 界限 人和动物正常组织的细胞,在体外传代代次数一般不超过50代 胎儿成纤维细胞可传50代,成人肺组织成纤维细胞一只能传20代 当体外培养的细胞发生转型(癌变)并形成细胞系时,即可在体外无限传代
石蜡切片最常用的染色技术 是苏木精-伊红染色技术(HE染色) 细胞核为蓝色,细胞质为红色