医用细胞生物学第三章

主要包含显微镜技术、 细胞的分离和培养、细胞组分的分离和纯化技术、 细胞化学和细胞内分子失踪技术等。

第三章 细胞生物学的研究方法

• 第一节 显微镜技术
  • 光学显微镜技术
    • 普通光学显微镜
      • 分辨率指能区分两点间的最小距离
      • 0.5微米×1微米 能观的最小细胞结构：线粒体
      • 显微结构
      • 最大放大倍数2000倍
      • 固定→切薄片→包埋→染色
      • 适用的切片厚度为1~10微米
    • 相差显微镜
      • 用于观察活细胞（的运动）
        • 使活细胞内各种结构形成明暗对比
      • 倒置相差显微镜
        • 观察培养细胞的结构
        • 可清晰看到培养瓶内的贴壁或悬浮细胞
      • 显微电影摄影术或电视录像
    • 暗视野显微镜
      • 通过散射光成像
      • 观察物体轮廓，分辨不清内部细微结构
      • 用于观察活细胞内细胞核和线粒体、液体中细菌和真菌、细胞的运动
    • 荧光显微镜
      • 荧光分子吸收激发光，发射出波长更长的发射光
      • 两组滤光片
      • 可以形成强反差的彩色图像
    • 共聚焦激光扫描显微镜
      • 分辨率增强，使对细胞内部结构进行"光学切片”成为可能
      • 产生一系列二维图像，计算机重建后得到完整的三维图像
    • 超分辨光学显微镜
      • 利用可见光，非接触、无损伤、可观测内部结构
      • 观测活细胞或活的组织，并可进行内部深层三维结构成像
      • 分辨率达到30~50nm
  • 电子显微镜技术
    • 透射电子显微镜（TEM）
      • 电镜标本要置于高真空观察，故无法观察含水的活组织、细胞
      • 标本要特殊处理：迅速双重固定（防止样品在死亡后和脱水过程中发生结构改变）→脱水→包埋→切片(超薄约50~100nm)
      • 切片前后用重金属的盐类浸染标本进行电子染色，以增大反差
      • 高压透射电镜（HVEM)
        • 观察更厚电镜标本，分辨率更高
      • 借助金属投影、冰冻断裂、冰冻蚀刻技术可获取三维图像
        • 冰冻断裂多用于观察细胞膜性结构的内部结构，冰冻蚀刻用于观察细胞内部结构
    • 扫描电子显微镜（SEM）
      • 观察生物样品表面的立体结构（三维形态）
      • 样品要固定、干燥并用重金属膜覆盖
      • 分辨率较低，不如透射电镜，用于细胞整体或组织的观察
    • 冷冻电子显微镜
      • 即在低温下使用透射电镜
        • 样品冷冻→冷冻成像（二维）→三维重构（计算机处理）
  • 其他显微镜技术（纳米显微技术）
    • 扫描隧道显微镜
      • 直接观察大分子的三维结构
      • 可在大气和液体等非真空状态下工作，分辨率极高
    • 原子力显微镜
      • 分辨率不及扫描隧道显微镜，常用于活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面的观测
      • 可对单个分子进行操作
• 第二节 细胞的分离和培养
  • 不同类型细胞的分离
    • 利用细胞的物理和生物学特性 简单有效地分离和筛选细胞
    • 流式细胞术精确分选荧光标记的细胞
    • 免疫磁珠法可获得高纯度细胞 经过两次过柱分选可提高纯度
    • 激光捕获显微切割技术能从组织切片（冰冻切片）中方精确分离出单一细胞
  • 细胞培养
    • 培养条件：1.基础培养基＋天然生物成分如血清 2.要5%的二氧化碳 3.无菌环境
    • 主要方式：原代和传代培养（1：2比例扩大培养）
    • 细胞系（在体外无限繁殖、传代）：1.自恶性肿瘤组织的细胞 2.正常组织的细胞经诱变产生“不死”细胞
    • 细胞株：用细胞克隆化的方法改善细胞均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成细胞群即 细胞株
• 第三节 细胞组分的分离和纯化技术
  • 细胞裂解：基本原则是在裂解液中加入渗透压维持剂和蛋白酶抑制剂
    • 物理方法如低渗透压、超声振荡、研磨、机械破碎等
    • 去垢剂能溶解膜性结构 包含离子型、非离子型、兼性离子型
    • 离液剂如尿素，但对蛋白质和膜脂有强的变性作用，常用于无需保持蛋白质活性的样品制备和细胞核酸的抽提
  • 细胞器及细胞组分的分级分离
    • 差速离心法分离体积和质量差别较大的颗粒
    • 速度沉降分离沉降系数不同的颗粒，其中沉降系数取决于大小和形状
    • 平衡沉降分离密度不同的颗粒，取决于浮力密度于大小形状无关
  • 蛋白质的分离与鉴定
    • 层析法：普通柱层析法和高压液相层析法都可维持蛋白质不变性
    • 电泳法：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和等电聚焦电泳法 以及二者相结合的双向电泳
  • 核酸的分离与鉴定
    • 差速离心法是分离纯化核酸的常用方法
    • 凝胶电泳法是核酸分离鉴定的主要方法：经离心沉淀后的核酸分子，通过凝胶电泳可直接判定核酸的纯度、完整性和片段大小。琼脂糖凝胶电泳分辨率小，不适合分辨100碱基以下的分子；丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，多用于分辨500以下的核酸分子
• 第四节 细胞化学和细胞内分子失踪技术
  • 酶细胞化学技术
  • 免疫细胞化学技术
  • 放射自显影技术
  • 活细胞内分子失踪
    • 离子探针进行活细胞内离子的实时检测 绿色荧光蛋白（GFP)用于定位显示特定蛋白(在共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察） 荧光共振能量转移实现观察蛋白质间的相互作用 单分子失踪技术研究细胞内大分子的行为和功能 单分子荧光成像和原子力显微镜是活细胞中单分子研究的两种核心技术
• 第五节 细胞功能基因组学研究技术
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